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柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing Disease,HLB)由韧皮部难养菌引起,是严重影响全世界柑桔生产的重大检疫性病害之一。柑桔发病后轻者影响产量和品质,重者造成柑桔树的枯死。目前除严格防治木虱和挖除病树外,国内外对柑桔黄龙病尚无很好的根除方法,唯有通过设立和建设无病区、加强植物检疫严防病害传入。因此,加强病害的早期诊断和检测技术的研究尤为重要。柑桔黄龙病菌的传统检测技术都存在一定的局限性,如特异性差、灵敏度低,尤为关键的是不能对病害进行早期快速准确检测。而核酸水平的分子检测技术具有快速、特异、灵敏的特点,可以满足国内外现代植物检疫的要求。研究目的:本文对柑桔黄龙病菌核酸分子检测技术和生物大分子常温贮藏技术进行了系统的研究,旨在建立起快速准确稳定安全的柑桔黄龙病菌分子检测技术体系,实现柑桔样品的快速检验,为柑桔非疫区生产建设和病害预警监测提供一种分子检测技术和实用工具。研究方法:利用CTAB 法,试剂盒法和浸泡过滤法提取柑桔黄龙病菌的核酸DNA;利用引物和探针设计软件Primer Premier 5.0 进行引物和探针的设计;PCR同步扩增柑桔叶面腐生菌,柑桔溃疡病菌和衰退病菌等等植物细菌和病原物来验证检测的特异性;PCR 扩增含有靶片段的质粒DNA 测定检测的灵敏度;通过在不同DNA 扩增仪和温度控制方式下的扩增程序优化测定检测的稳定性。将靶片段与克隆载体pMD-18T 连接后,用CaCl2法转化大肠杆菌(E. coli,JM109),然后通过测序来验证PCR 扩增产物的准确性;以重组质粒和转化的大肠杆菌构建了无害化阳性参照体系。采用预混PCR 反应液中加入生物活性分子稳定剂并冷冻干燥固相化处理的方法研制出能常温贮存的方便有效的检测试剂盒。利用优化的分子检测体系对江西、浙江、广西、湖南、重庆和四川等地采集的柑桔样品进行了PCR实际检测。利用iCycler iQ定量PCR 仪对柑桔黄龙病的定量检测做了初步的研究。研究结果: 1) 通过比较研究不同制样方法对检测效果的影响,确定浸泡过滤法能有效地排除植物色素、蛋白质、多糖等物质对PCR 反应的干扰,制备适合于PCR 反应的靶细菌DNA,避免PCR 反应的假阴性发生。2) 根据柑桔黄龙病菌核糖体蛋白基因设计筛选了不同的引物对,筛选出特异性强稳定性好灵敏度高的引物对CQULAF3/CQULAR3,并由此建立了准确、快速、灵敏、稳定、安全的柑桔黄龙病菌PCR 检测体系。3) 在引物CQULAF3/CQULAR3 扩增产物中设计了引物CQULAF4/CQULAR4,