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酶联免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)在临床检验、卫生检验及生物医学基础研究领域应用广泛,但经典ELISA只能测定单组份且效率低。基于快速变换光度计测量波长能实现光度法双酶同钡(?) (spectrophotometric-dual- enzyme-simuLtaneous assay, SDESA) 。用ELISA基于SDESA同步测定两组份称SDESA-ELISA,其使分析效率加倍。酶标仪标配滤光片为405 nm和450 nm; SDESA-ELISA配对标记酶为水解酶并需满足以下条件：(1)标记酶A水解显色底物A的最大等吸收波长在405nm附近,标记酶B所得显色产物B的最大差吸收峰在405 nm附近；(2)配对标记酶缓冲液兼容,且比活都足够高；(3)配对标记酶都有良好稳定性；(4)两种标记酶的显色产物和显色底物对酶活性干扰可忽略。筛选发现4-硝基-萘基磷酸酯(4-nitro-1-naphthy lphosphate,4NNPP)为底物A,大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase, ECAP)活性和稳定性都满足要求,需筛选与其最适缓冲液相容且显色底物及产物对活性无干扰的标记酶B。限于最适pH,仅乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase, AChE)及绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsuLphatase, PAAS)为候选标记酶B。本项目比较PAAS和AChE与ECAP配对进行SDESA的有效性和性能差异,并建立PAAS定向进化系统。1.ECAP和AChE组合进行SDESA的表征ECAP水解4NNPP产物4-硝基-1-萘酚(4-Nitro-1-naphthyl,4NNP)在450nm附近有最大差吸收峰波长,在405nm附近为最大等吸收波长。AChE催化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine chloride, ATCh)水解后在显色剂5,5’-二硫双(2-硝基苯甲)(5,5-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB)作用下产物为NTB,在410nm左右有最大差吸收峰波长。ECAP和AChE在相同碱性Tris-HCl缓冲液中比活和稳定性基本满足要求。对ECAP和AChE,校正吸收后SDESA灵敏度、检测限、线性范围与单组份测定一致。但ATCh稳定性差,不便于配制即开即用试剂盒。2. ECAP和PAAS组合进行SDESA的表征PAAS催化对硝基苯酚硫酸钾(4-nitrophenol potassium,4PNS)水解产物对硝基苯酚(Nitrophenol,4PNP)最大差吸收峰在405nm左右。ECAP和PAAS在碱性DEA-HCl缓冲液中均表现出其最佳比活；对ECAP和PAAS进行SDESA的灵敏度、检测限、线性范围与单组份测定基本一致,且显色底物光谱性质更匹配,显色底物很稳定。野生型PAAS最高比活仅为39 kU/g,37度热失活半衰期仅4天。为了灵敏度与单组份ELISA相当,PAAS突变体的活性需提高20倍以上且在37度15天活性保留85%以上。因此,需对PAAS进行分子改造提高活性和稳定性,才能与碱性磷酸酶组合用于SDESA-ELISA。3. PAAS的定向进化系统据PAAS编码序列全合成基因插入pET28a构建N-端带6His的表达载体,最后转化到BL21(DE3)中表达成功。用易错PCR(Error-pronePCR)针对PAAS的C端水解酶进行突变获得突变体以建立定向进化系统。改变Mg2+、Mn2+、Tm,或组合进行易错PCR,再酶切、连接后将突变序列在大肠杆菌中表达得到PAAS突变体。将LB平板上单克隆扩大培养后测序,选取突变率为0.5%-2.0%的易错PCR条件作为建立PAAS突变体库的优选条件。已报道方法高通量筛选酶突变体库工作量大、漏检率高、准确度低。本文建立如下的高通量筛选方案：(1)48孔板高通量培养PAAS单克隆菌方法：批内和批间变异系数约20%,主要原因是LB平板的单克隆生长差异无法消除；(2)高通量碱裂解诱导表达后细胞。裂解液缓冲液含1.0MTris-HCl(Ph 9.0)、辅助成份吐温-20(1/1000)和对氨基苯甲脒(2u M)。碱裂解液与PAAS菌液诱导表达后菌液按8：1比例混合,室温震荡裂解3-6小时,裂解液中酶活性达到平台；(3)在酶标仪用96孔板中高通量测定碱裂解液中PAAS活性；(4)选择PAAS活性相差2倍的突变体M72Q和G138S,受试者工作曲线(ROC)分析曲线下面积(AUC),选择90%敏感度对应最大特异度的活性为阈值识别比活增加1倍以上的阳性突变体。