研究目的和意义：A 型流感病毒（influenza A virus，IAV）可引起广泛的动物感染，且在流行中极易发生变异，当不同的IAV 混合感染时就可能会发生基因重配。这种基因重配，自然会导致病毒生物学性质的改变，其中最重要的就是病毒致病力的增加以及感染宿主的改变，导致跨物种间传播感染。近来发现A 型流感病毒的NS1 蛋白可与PI3K的调节亚基p85的SH3区域相结合，从而激活PI3K/Akt（磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B）信号通路。文献表明，激活的PI3K/Akt 信号通路有利于病毒的复制。为检测体外构建的SH3 片段能否与正常胞内存在p85β的SH3 位点相竞争，从而抑制病毒的复制能力，本实验通过构建pcDNA-SH3质粒（pcDNA的N 端携带有Flag 标签），转染至MDCK 细胞中表达，然后检测对不同A型流感病毒株复制的影响，以及检测病毒感染后的细胞内磷酸化Akt的表达。　　 材料和方法：　　 1. 构建SH3 质粒(pSH3)：以PNF 质粒（在pCDNA的N 端加上Flag 标签）为载体，在BamHI和EcoRI 两个位点中插入p85β的SH3 区域（9-79aa）序列；构建NS11，NS32和NS92 质粒(pNS11,pNS32和pNS92)：以pEGFP-c1 为载体，在BamHI 酶切位点插入H1N1，H3N2和H9N2的NS1 蛋白全长序列。　　 2. 在MDCK 细胞中共转染pSH3和pNS11(或pNS32,pNS92)，通过共聚焦显微镜观察共定位现象。　　 3. 在MDCK 细胞中转染pSH3，48h后进行不同A 型流感病毒株（PR8，ST1233，ST364，Ph2246和Qa199）感染（MOI=0.001），每12h 取上清，将上清进行病毒滴度测定。　　 4. 在MDCK 细胞中转染pSH3，24h后进行不同A 型流感病毒株（PR8，ST1233，ST364，Ph2246和Qa199）感染（MOI=2），感染8h后取细胞裂解液，通过WesternBlot检测Akt-P（Ser473）的表达情况。　　 5. MDCK 细胞预先用LY294002（PI3K 抑制剂）处理2h，然后进行不同A 型流感病毒株（PR8和ST364）感染（MOI=2）1h，进行病毒空斑实验。检测PI3K/Akt 通路对PR8和ST364 两株病毒复制的作用。　　 结果及结论：　　 1. 构建好的pSH3，pNS11，pNS32和pNS92 质粒经过DNA 测序正确。　　 2. 通过共聚焦显微镜，可以观察到在MDCK 细胞中，h-SH3与NS1 蛋白（NS11，NS32 或NS92）主要分散分布或以一些点状结构分布在胞核内，同时SH3 片段和NS1 蛋白能够共定位。因此h-SH3 能与不同的A 型流感病毒亚型（H1N1，H3N2和H9N2）的NS1蛋白相结合。　　 3. MDCK 细胞转染pSH3，48h后感染不同A 型流感病毒株（PR8，ST1233，ST364，Ph2246或Qa199）后，每12h 取的上清病毒滴度比正常的MDCK 细胞感染病毒后相比较呈不同程度的下降。取下降最大的时间点观察，ST364 病毒滴度有8 倍下降，Qa199 病毒滴度有6 倍下降，Ph2246 病毒滴度有4 倍下降，ST1233和PR8 病毒滴度均有2 倍下降。H-SH3具有不同程度的抑制A 型流感病毒株（PR8，ST1233，ST364，Ph2246和Qa199）的复制能力，说明不同A 型流感病毒株的NS1 蛋白对h-SH3 敏感性不同。　　 4. MDCK 细胞转染pSH3，24h后感染不同A 型流感病毒株（PR8，ST1233，ST364，Ph2246或Qa199），8h后细胞裂解液通过WesternBlot检测Akt-p及Akt-T 变化。我们观察到除了ST1233 病毒株，其余四株病毒感染后MDCK 细胞的Akt-p水平均上升；另外，PR8和ST364 病毒株的Akt-P/Akt-T 比值下降，但其他三种病毒株的Akt-P/Akt-T 比值无差异。　　 说明在无病毒感染时，h-SH3 不会影响正常MDCK 细胞PI3K/Akt 信号通路，而且h-SH3的抑制病毒复制能力，是具有病毒株的特异性。　　 5. 预先用LY294002 处理的MDCK 细胞，再用A 型流感病毒感染（ST364 或PR8）1h后进行空斑实验，发现处理后的细胞ST364 病毒滴度比正常细胞的滴度有明显下降，而PR8病毒滴度在处理前后细胞都无明显改变。提示PI3K/Akt 信号通路有利于ST364 病毒复制作用，而对PR8 病毒复制不敏感。