目前,结直肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年上升。结直肠癌的治疗以手术为主,辅以放化疗,但疗效欠佳,尤其是中晚期结直肠癌治疗效果更差。阐明结直肠癌转移的分子机制并为临床治疗提供理论和实验依据显得尤为重要。microRNA是一类具有调控功能的小分子非编码RNA,通常包含19-24个核苷酸。成熟的miRNA是由较长的pre microRNAs经过一系列核酸酶切反应加工形成,可通过碱基互补配对的方式识别靶基因3’UTR区非编码mRNA,与之相结合从而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译。miRNAs通过不同的靶基因,参与调控了生物体多种生命进程,比如肿瘤发生和发展、器官造血、组织发育和分化、细胞增殖和凋亡及基础代谢等；同时miRNAs还可以对多种生物体基础信号通路发挥调控作用。基于此,miRNA对于肿瘤潜在的诊断、治疗和预后评估中的价值成为近年来的研究热点。本课题从结直肠癌组织和细胞miRNA芯片中筛选出miR-214作为结直肠癌转移和放疗抵抗候选miRNA,探讨miR-214在结直肠癌侵袭、转移和放疗抵抗中的作用机制,主要内容如下：(1)筛选并验证结直肠癌转移和放疗抵抗相关的miRNA;(2)预测并鉴定miR-214的靶基因,明确miR-214通过其靶基因如何在结直肠癌侵袭、转移和放疗抵抗中发挥作用；(3)确定miR-214上游转录因子,探讨两者之间的相互调控关系及转录因子在结直肠癌侵袭、转移和放疗抵抗中的作用。本课题旨在揭示miR-214新的表达调控机制,阐明FOXD3/miR-214/靶基因轴在结直肠癌发生发展中的作用机制,为肿瘤诊治提供新的思路及治疗靶点。研究方法1.结直肠癌组织和细胞中异常表达miRNAs筛选及验证利用miRNA芯片初步筛选出在结直肠癌组织和细胞中差异表达明显且与转移和放疗相关的miR-214,利用荧光定量PCR验证miR-214在结直肠癌组织和细胞中表达情况。2. miR-214靶基因的预测和鉴定以miR-214为关键词,使用miRanda、TargetScan、Pictar和RNAhybrid数据库对miR-214靶基因进行预测,挑选交集多且预测值高并通过查阅文献寻找转移和放疗相关靶基因MED19和CDC25A,采用双荧光素酶报告基因进行确定,并利用荧光定量PCR和Western blot检测miR-214及其靶基因在六株结直肠癌细胞中的表达并进行相关性分析。3.miR-214对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)设计并构建miR-214慢病毒表达载体,进行慢病毒包装,感染SW480和HCT116细胞,经流式细胞仪分选稳定表达的细胞株,利用荧光定量PCR验证miR-214的表达；(2)将miR-214慢病毒表达载体和不含3’UTR的两个靶基因(MED19和CDC25A)编码区表达慢病毒载体共转染至SW480和HCT116细胞中,构建稳定表达的细胞株,利用Western blot检测MED19和CDC25A的表达变化；(3)采用CCK-8、平板克隆、体外侵袭、Western blot及细胞免疫荧光实验,检测miR-214表达载体及miR-214和靶基因(不含3’UTR)共表达载体转染后对结直肠癌细胞株SW480和HCT116体外增殖、侵袭及放疗耐受的影响；(4)利用整体可视化动物模型,检测miR-214表达载体及miR-214和MED19(不含3’UTR)表达载体共转染后对结直肠癌细胞株SW480对裸鼠皮下成瘤及尾静脉注射体内肺转移能力的影响。4.miR-214上游转录因子预测并验证及体内外功能研究(1)寻找miR-214上游启动子的基因组序列,在线软件预测可能与miR-214启动子结合的转录因子,使用双荧光素酶报告基因检测转录因子对miR-214启动子转录活性的影响,并用染色质免疫共沉淀验证两者之间具体的结合位点；利用荧光定量PCR检测转录因子过表达后miR-214表达情况。(2)利用荧光定量PCR和Western blot检测6株结直肠癌细胞中FOXD3的表达,设计并构建干扰FOXD3慢病毒表达载体,并将shFOXD3慢病毒载体及shFOXD3/miR-214慢病毒表达载体共转染至结直肠癌细胞株SW480和SW620中,经流式细胞仪分选稳定细胞株,利用Western blot和荧光定量PCR检测FOXD3和miR-214的表达。(3)利用CCK-8、平板克隆、体外侵袭、Western blot及细胞免疫荧光方法,检测shFOXD3及shFOXD3/miR-214对结直肠癌细胞株SW480和SW620体外增殖、侵袭及放疗的影响；(4)利用整体可视化动物模型,检测SW620/shFOXD3及SW620/shFOXD3/miR-214对裸鼠皮下成瘤及尾静脉注射体内肺转移能力的影响。采用SPSS13.0统计软件包进行处理,多组间的均数比较采用单因素方差分析,方差分析前进行方差齐性检验,方差齐采用oneway Anova,多重比较采用LSD法；方差不齐采用近似F检验的Welch法,多重比较采用Dunnett’s T3法；多组均数多重比较采用析因方差分析,两组均数比较采用独立样本t检验。研究结果1.结直肠癌转移及放疗相关miRNA的筛选及鉴定(1)送检3张miRNA芯片结果表明,与正常结直肠粘膜组相比,在结直肠癌组及远处转移组中共筛选出42个表达均下调的miRNA,其中包括miR-214。本课题组对结直肠癌SW837细胞8Gy放疗前后送检miRNA芯片,结果表明,与放疗前比,放疗后SW837细胞中miR-214表达显著降低,提示miR-214与侵袭、转移和放疗密切相关。(2)利用荧光定量PCR检测30例配对新鲜结直肠癌组织中miR-214的表达,通过配对样本T检验结果显示：miR-214在结直肠癌组织中的表达显著低于正常粘膜组织(t=2.285,P<0.001)；进一步将30例结直肠癌组织分为伴远处转移组及不伴有转移组,结果表明,miR-214在伴远处转移结直肠癌组织中的表达显著低于不伴转移结直肠癌组织(t=2.175,P<0.001)。荧光定量PCR检测miR-214在6种结直肠癌细胞株中的表达,单因素方差分析显示,miR-214在5株细胞之间的差异,具有统计学意义(F=114.632, P<0.001)。SW480和HCT116细胞分别在OGy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy剂量放疗,24小时后收集细胞,荧光定量PCR检测miR-214表达,结果表明,随着放疗剂量增加miR-214表达是逐渐降低,差异具有统计学意义(F=1029.532, P<0.001; F=618.172, P<0.001)。2.miR-214靶基因的预测及鉴定(1)miR-214转移和放疗抵抗相关靶基因的生物信息学预测通过四个常用在线预测数据库和查阅文献预测与miR-214相互作用的靶基因,结果显示MED19(4个软件均预测到)与增殖和转移相关,CDC25A (2个软件预测到)与放疗相关。因此,我们假设MED19和CDC25A作为miR-214的靶基因。(2)在HEK293A、SW480和HCT116细胞中,转染psiCHECKTM-2-MED19-3’UTR载体结果显示：与Mock组和MED19组比,miR-214/MED19共转染组荧光素酶活性均降低,具有统计学意义(F=15.426, P<0.005; F=59.820, P<0.001;F=73.500,P<0.001),表明miR-214能够与MED193’UTR结合,从而抑制荧光素酶的活性；转染psiCHECKTM-2-CDC25A-3’UTR载体结果显示：与Mock组和CDC25A组比,]miR-214/CDC25A共转染组荧光素酶活性均降低,具有统计学意义(F=35.618, P<0.010; F=313.848; P<0.001; F=100.236, P<0.001),表明miR-214能够与CDC25A3’UTR结合,从而抑制荧光素酶的活性。(3) Western blot检测MED19和CDC25A在6种结直肠癌细胞株中的表达,结果表明,MED19在HCT116、SW480、SW620、LOVO、LS174t和HT29细胞中表达逐渐降低；CDC25A在HCT116、SW480、LS174t、SW620、LOVO和HT29细胞中的表达是逐渐降低。(4)利用Quantity One软件对MED19和CDC25A蛋白Western blot结果进行条带灰度分析,然后分别与miR-214荧光定量PCR结果进行Spearman相关性分析,结果表明在6种结直肠癌细胞株中,miR-214与靶基因MED19,miR-214与靶基因CDC25A的表达呈显著负相关(r=-0.920,P<0.001；r=-0.829,P=0.042)。3.miR-214过表达及回复靶基因后对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)荧光定量PCR检测SW480和HCT116细胞中miR-214组、Mock组、miR-214/MED19共转染组和miR-214/CDC25A共转染组中的miR-214表达变化,结果表明,SW480和HCT116细胞株中四组间miR-214的表达差异均具有统计学意义(F=47219.146, P<0.001; F=17177.032, P<0.001)。两两比较结果表明,与Mock组相比,miR-214组中miR-214表达显著增高,具有统计学意义(P<0.001,P<0.001),而与miR-214组相比,miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组中miR-214表达变化不明显,差异不具有统计学意义(P=0.946,P=0.594；P=0.747,P=0.749)。结果表明miR-214转染成功,并且MED19和CDC25A重新导入后,对miR-214的表达没有明显影响。(2) Western blot检测SW480和HCT116细胞中Mock组、miR-214组、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组的MED19和CDC25A蛋白表达变化,结果表明,与Mock组相比,在miR-214组中MED19和CDC25A蛋白表达明显下降,而分别重新转染MED19和CDC25A后,MED19和CDC25A蛋白表达又上升。结果表明,miR-214能下调MED19和CDC25A蛋白表达。(3)CCK-8法检测SW480和HCT116细胞中Mock组、miR-214组、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组的体外增殖能力并绘制细胞生长曲线。析因设计方差分析表明,MED19靶基因结果显示：SW480和HCT116细胞株中时间与分组之间交互效应有显著性的差异,具有统计学意义(F=52.77,P<0.001；F=62.274,P<0.001),生长时间水平有显著性的差异,具有统计学意义(F=2607.833, P<0.001; F=35.355, P<0.001),三组间细胞增殖能力组间有显著性的差异,具有统计学意义(F=271.281, P<0.001; F=4.376, P<0.001)。两两比较结果表明：SW480细胞生长时间第4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P<0.05),细胞增殖能力组间3天、4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P<0.05)。CDC25A靶基因结果显示：SW480和HCT116细胞株中时间与分组之间交互效应有显著性的差异,具有统计学意义(F=43.861,P<0.001；F=39.225,P<0.001),生长时间水平有显著性的差异,具有统计学意义(F=2170.620, P<0.001; F=1501.804, P<0.001),组间细胞增殖能力有显著性的差异,具有统计学意义(F=227.617, P<0.001; F= 173.087, P<0.037)。两两比较结果显示：HCT116细胞生长时间第4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P<0.05),细胞增殖能力组间4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P<0.05)。以上结果表明,miR-214通过靶基因(MED19和CDC25A)抑制结直肠癌细胞体外增殖。(4)平板克隆形成实验检测SW480和HCT116细胞中Mock组、miR-214组和miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组平板克隆形成能力的变化,结果表明,与Mock组相比,miR-214组平板克隆形成能力显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001；P<0.001)；与miR-214组相比,miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组平板克隆形成能力又增加,具有统计学意义(P<0.001；P<0.001)。以上结果表明,miR-214通过靶基因(MED19和CDC25A)抑制结直肠癌细胞平板克隆形成能力。(5)平板克隆形成实验检测不同剂量放疗后SW480和HCT116细胞中克隆形成能力。实验结果表明,与Mock组相比,随着放疗剂量增加,miR-214组细胞的放疗敏感性明显降低,克隆形率升高(P<0.001)；与miR-214组相比,miR-214/CDC25A共转染组细胞对放疗敏感性又增加,克隆形成率又降低(P<0.001)。(6)免疫荧光和Western blot检测发现,SW480和HCT116细胞经4Gy放疗12小时后,免疫荧光结果：与Mock组相比,miR-214组细胞内γ-H2AX小体焦点数量显著减少,具有统计学意义(P<0.001)；而与miR-214组相比,miR-214/CDC25A共转染组细胞内γ-H2AX小体焦点数量显著增多,具有统计学意义(P<0.001)。Western blot结果：与Mock组相比,miR-214组细胞中γ-H2AX蛋白表达明显减少；而与miR-214组相比,miR-214/CDC25A共转染组细胞中γ-H2AX蛋白表达又增加。上述结果表明,miR-214通过CDC25A导致结直肠癌细胞的放疗抵抗。(7)利用Boyden侵袭小室检测SW480和HCT116细胞中Mock组、miR-214组和miR-214/MED19共转染组细胞的体外侵袭能力变化,SW480和HCT116细胞的三组间侵袭能力显著性差异,具有统计学意义(F=110.710,P<0.001；F=95.564,P<0.001)。两两比较之后发现,与Mock组相比,miR-214组细胞穿过膜的数目显著性减少,具有统计学意义(P<0.001)；与miR-214组相比,miR-214/MED19共转染组细胞穿膜数量明显增多,具有统计学意义(P<0.001)。结果表明miR-214通过MED19抑制结直肠癌细胞体外侵袭能力。(8)采用SW480/Mock、SW480/miR-214与S W480/miR-214/MED 19三组细胞进行裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射体内肺转移实验,裸鼠皮下成瘤单个重复测量因素的方差分析结果显示：三种细胞皮下成瘤能力都具有明显差异(F=153.593, P<0.001; F=45.355, P<0.001; F=53.981, P<0.001)。两两比较后发现,与Mock组相比,miR-214组皮下瘤生长速度明显降低(P<0.001)；与miR-214组相比,miR-214/MED19共转染组皮下肿瘤生长速度明显上升(P<0.001)。免疫组织化学染色对皮下瘤进行KJ-67染色结果,Mock组、miR-214组和miR-214/MED19共转染组Ki-67阳性率分别为87.84%、19.467%和59.58%。裸鼠尾静脉注射体内肺转移实验结果：三种细胞均在肺脏表面可见明显的转移灶,Mock组、miR-214组和miR-214/MED19共转染组中裸鼠出现肺脏转移率分别为100%(6/6)、33.33%(2/6)和66.67%(4/6)。以上结果表明,miR-214通过MED19抑制结直肠癌细胞皮下成瘤及体内肺转移能力。4.miR-214上游转录因子的预测、验证及其在结直肠癌细胞中的生物学特性(1)通过Ensembl在线数据库,获得编码miR-214前体序列所在基因的上游2kb作为miR-214的启动子序列。(2)利用Consite和TFsearch在线软件预测并分析可能与miR-214启动子结合的转录因子,综合考虑选择FOXD3作为miR-214上游转录因子。(3)利用双荧光素酶报告基因检测miR-214启动子和FOXD3之间的荧光素酶活性,结果表明,HEK293A和SW480细胞转染PGL3-miR-214质粒时,与blank组相比,其荧光素酶活性增高,具有统计学意义(P<0.001；P<0.001),表明miR-214启动子序列是有启动转录活性；共转染PGL3-miR-214和pEGFP-FOXD3时,与PGL3-miR-214组相比,荧光素酶活性显著增加,具有统计学意义(P<0.001；P<0.001),进一步表明FOXD3能够明显促进miR-214启动子的转录活性。(4)利用染色质免疫共沉淀检测miR-214启动子和转录因子FOXD3之间的结合位点,结果表明,miR-214启动子与FOXD3之间存在着一个直接结合位点。(5)荧光定量PCR检测SW480和SW620细胞转染pEGFP-FOXD3质粒后miR-214的表达。结果表明,两种细胞转染pEGFP-FOXD3后,FOXD3的表达显著升高,具有统计学意义(t=-18.038,P<0.001；t=-13.877,P<0.001),证实转染成功。此外,转染pEGFP-FOXD3后,与Mock组相比,两种细胞中miR-214表达显著升高,差异具有统计学意义(t=-31.409,P<0.001；t=-17.720,P<0.001),提示FOXD3能促进miR-214的表达。(6)荧光定量PCR和Western blot检测FOXD3在6种结直肠癌细胞株中的表达。结果表明,FOXD3在HT29、SW620、LS174t、SW480、LOVO和HCT116细胞中表达逐渐降低,为进一步研究FOXD3与miR-214之间正向调控关系,后续实验中选取SW620和SW480做为干扰FOXD3细胞株。(7) Western blot检测FOXD3三个干扰片段在SW480和SW620细胞中干扰效率,结果表明,siRNA3在SW480和SW620细胞中干扰效率最高。因此,选用siRNA3片段用来包被干扰FOXD3慢病毒,构建稳定细胞株。利用Western blot检测SW480和SW620稳定细胞中NC组、shFOXD3组、shFOXD3/miR-214共转染组中FOXD3蛋白表达变化,结果表明,在SW480和SW620细胞中,与NC组相比,shFOXD3组细胞中FOXD3蛋白显著下降,而重新转染miR-214后,FOXD3蛋白表达几乎没有变化。以上结果表明,成功构建SW480和SW620稳定干扰FOXD3细胞株。(8)CCK-8法检测NC、shFOXD3、shFOXD3/miR-214对结直肠癌细胞株SW480和SW620体外增殖能力的影响并绘制细胞生长曲线。析因设计方差分析结果表明：SW480和SW620细胞中时间与分组之间交互效应有显著性的差异,具有统计学意义(F=59.307,P<0.001；F=89.725,P<0.001)；3个组生长时间水平有显著性的差异,具有统计学意义(F=5395.231,P<0.001；F=16869.718,P<0.001),组间细胞增殖能力有明显差异,具有统计学意义(F=330.935,P<0.001；F=614.063,P<0.001)。两两比较结果表明,与NC组相比,shFOXD3组细胞增殖速度显著增加,说明干扰FOXD3后能够增加细胞体外增殖能力,而与shFOXD3组相比,shFOXD3/miR-214共转染组细胞增殖速度又降低。结果表明,FOXD3通过miR-214抑制结直肠癌细胞体外增殖能力。(9)平板克隆形成实验检测NC、shFOXD3、shFOXD3/miR-214对结直肠癌细胞株SW480和SW620平板克隆形成能力的影响并绘制细胞生长曲线变化。实验结果表明,与NC组相比,shFOXD3组的平板克隆形成能力明显增加,具有统计学意义(P<0.001；P<0.001)；与shFOXD3组相比,shFOXD3/miR-214共转染组平板克隆形成能力又降低,(P<0.001；P<0.001),以上结果说明FOXD3通过miR-214抑制结直肠癌细胞平板克隆形成能力。(10)利用Boyden侵袭小室检测NC、shFOXD3、shFOXD3/miR-214对结直肠癌细胞株SW480和SW620体外侵袭能力的影响,结果显示SW480和SW620细胞各组间细胞运动能力有显著性的差异,具有统计学意义(F=91.221,P<0.001;F=89.463,P<0.001),两两比较发现,与NC组相比,shFOXD3组细胞穿过膜的数目显著性增多,具有统计学意义(P<0.001)；与shFOXD3组相比,shFOXD3/miR-214共转染组细胞穿膜数量明显减少,具有统计学意义(P<0.001),结果表明,FOXD3通过miR-214抑制结直肠癌细胞体外侵袭能力。(11)平板克隆形成实验检测不同剂量放疗后SW480和SW620细胞中NC组、shFOXD3组、shFOXD3/miR-214共转染组的克隆形成能力。实验结果表明,三组之间放疗后细胞克隆形成率没有显著性差异,不具有统计学意义(P>0.05)。(12)免疫荧光和Western blot检测发现,SW480和SW620细胞经4Gy放疗12小时后,免疫荧光结果：三组之间细胞内γ-H2AX小体焦点数量没有明显变化,不具有统计学意义(P>0.005)。Western blot结果：三组之间细胞内γ-H2AX蛋白表达变化不明显。上述结果表明,在结直肠癌细胞中FOXD3可能与放疗没有明显的相关性。(13)采用SW620/NC组、SW620/shFOXD3组和SW620/shFOXD3/miR-214共转染组细胞进行裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射体内肺转移实验,裸鼠皮下成瘤单个重复测量因素的方差分析结果显示：三种细胞裸鼠皮下成瘤能力都具有明显差异,具有统计学意义(F=402.994,P<0.001；F=256.014,P<0.001；F=41.996,P<0.001)。两两比较后发现,与NC组相比,shFOXD3组裸鼠皮下肿瘤生长速度明显增快(P<0.001)；与!shFOXD3组相比,shFOXD3/miR-214共转染组皮下肿瘤生长速度下降(P<0.001)。免疫组织化学染色对裸鼠皮下瘤进行Ki-67染色结果显示,NC组、shFOXD3组和shFOXD3/miR-214共转染组细胞Ki-67阳性率分别37.333%、81.000%和52.000%。裸鼠尾静脉注射体内肺转移实验结果显示：三组细胞均在肺脏表面可见明显的转移灶,NC组、shFOXD3组和shFOXD3/miR-214共转染组裸鼠出现肺脏转移率分别为16.667%(1/6)、83.333%(5/6)和50.000%(3/6)。以上结果表明：FOXD3通过miR-214抑制结直肠癌细胞株皮下成瘤及肺转移能力。结论1、miR-214下调与结直肠癌转移和放疗敏感密切相关。2、FOXD3/miR-214/MED19轴抑制结直肠癌增殖和侵袭转移；3、miR-214通过靶基因CDC25A增强结直肠癌放疗抵抗能力。本研究的创新之处：1、阐明FOXD3/miR-214/MED19轴在结直肠癌侵袭转移中关键作用,为肿瘤诊治提供新的思路及治疗靶点。2、提出miR-214可能在结直肠癌转移患者进行放射治疗前具有预测价值。