研究背景及目的：白血病约占儿童恶性肿瘤的三分之一,在发达地区的大城市中,恶性肿瘤已是儿童首位的致死疾病,而白血病首当其冲,深入研究儿童白血病的防治有重要的科学意义和社会意义。白血病的治疗以化学药物治疗(化疗)为主要。目前在临床使用的多数化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞的选择性低,在杀伤肿瘤细胞的同时容易引起严重不良反应如：骨髓抑制、严重感染等。因此,肿瘤的靶向治疗方式受到日益关注。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在生物进化过程中由高度保守的双链RNA诱发的,使同源的mRNA发生高效特异性降解的现象。由于该技术可以使特定的基因表达发生特异性剔除或关闭,所以在遗传性疾病、传染性疾病和恶性肿瘤等的基因治疗领域得到迅速发展。丝氨酸-精氨酸蛋白激酶(Serine-arginine protein kinases, SRPKs)是近年来发现的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族中一个重要的组成部分,其在丝氨酸特异性磷酸化的过程中起着重要作用。SRPKs在mRNA (Messenger RNA)的选择性剪接,体细胞和精子的核染色质重新分布,细胞周期和p53调控,细胞代谢信号等过程中均有至关重要的作用。其中研究最深入的是SRPK1。SRPK1作为一种SR(Serine-arginine)剪接因子磷酸化蛋白起着积聚功能信号和调控SRPKs家族其他成员的作用。目前研究认为SRPKs有可能成为肿瘤治疗的靶点,其原因在于在某些肿瘤细胞中发现SRPKs的高表达,对肿瘤细胞的SRPK1基因干扰后发现,肿瘤细胞的增殖率降低,凋亡潜能增加,并且对化疗药物的敏感性提高。本实验拟利用RNA干扰技术,以人类白血病K562细胞作为靶细胞,观察SRPK1基因沉默后对人K562细胞增殖和凋亡的影响。首先我们合成SRPKl-siRNA,将其转染至K562细胞内,采用MTT实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验等观察其对肿瘤细胞的影响。此外我们采用western blot实验进一步研究细胞凋亡的通路蛋白caspase-3、PARP和Bcl-2/Bax在K562细胞凋亡过程中的表达,为白血病的靶向治疗提供新的实验依据。研究方法：1.抑制SRPK1表达对白血病K562细胞增殖能力的影响(1)K562细胞系的培养取传代培养后的细胞,用吸管吹匀,收集至离心管中,1000rpm离心5min,弃上清,轻轻震荡悬起沉淀,加入5ml完全培养基,吹打均匀；将细胞悬液加入至培养瓶中,补充RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640)完全培养基至10ml；将培养瓶中置于37℃、5%CO2恒温箱中培养。(2)RNA干扰实验化学合成SRPKl-siRNA,按siRNA转染试剂盒说明,利用C10511-1 riboFectTM CP Transfection Kit(333T)转染试剂进行细胞转染。取相应体积和质量的特异性siRNA及其对照conRNA溶于100μl的RPMI1640培养基中,轻轻混匀；取一定体积的C10511-1 riboFectTM溶于100μl的RPMI1640培养基中,轻轻混匀；室温5分钟；把稀释的RNA和稀释的C10511-1 riboFectTM混匀,室温孵育20分钟；将200μl复合物加入到含有无血清培养基的细胞培养板中,轻轻晃动使充分混匀；4-6小时后换新鲜完全培养基,利用流式细胞术在相应的时间检测转染效率。(3)实时荧光定量PCR按照细胞总RNA提取步骤提取细胞的总RNA。取RNA样品,稀释100倍后在分光光度计上测定260nm、280nm处的吸光值。计算RNA浓度,公式(μg/ml) =A260×40(μg/ml)×稀释倍数。A260／A280处于1.9-2.0之间。根据RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis试剂盒的说明及操作步骤进行逆转录和实时荧光定量PCR,检测对照组及转染后细胞的SPRK1的表达。(4)MTT法检测细胞增殖收集对数期生长的K562细胞,调整细胞浓度,依照上述siRNA转染方法,分别转入50nM和100nM的siRNA;于37℃、5%CO：恒温箱中培养24h,48h,72h后,每孔加入10μl MTT (5mg/ml),继续培养4h；离心后弃上清,每孔加入100μl DMSO,在酶联免疫检测仪上,测定490nm处各孔光的吸收值(OD值),计算K562细胞增殖活性。(5)细胞周期检测收集转染后对数期生长的K562细胞,用70%乙醇重悬细胞固定30分钟；离心收集细胞后,用RNA酶消化细胞,室温放置30分钟；再次离心洗涤细胞,用PI染料处理细胞20分钟；在流式细胞仪488nm激发波长下测定。2.抑制SRPK1表达对白血病K562细胞凋亡的影响(1)流式细胞术检测细胞凋亡收集转染后对数期生长的K562细胞,用预冷的PBS洗一遍；离心收集细胞,用200μ1结合缓冲液重悬细胞；每管加5μl Annexin-V/FITC和10μl 20μg/mL PI溶液；室温避光孵育15分钟后,转入流式管,上机检测。(2) Western检测凋亡相关蛋白采用全蛋白提取裂解液提取细胞总蛋白后,在酶标仪读取OD595nm处光吸收值,绘制标准曲线,计算蛋白质含量。按照western实验技术的操作步骤检测凋亡通路蛋白caspase3、激活的caspase3、PARP、激活的PARP和Bcl-2/Bax的表达水平。3.统计方法采用数据分析软件IBM SPSS Statistics 20.0进行数据统计分析。双侧p<0.05认为有显著的统计学差异。采用“均数±标准差”的形式表示符合正态分布的连续变量。对连续变量采用t检验及方差分析。研究结果：1.抑制SRPK1表达对白血病K562细胞增能力的影响(1)流式细胞术检测siRNA转染后对细胞的抑制率为检测siRNA能否转染到K562细胞内,我们设计合成一个带GFP荧光标记的,与SRPK1无关序列的siRNA转染到K562细胞内,用流式细胞术检测转染效果。结果显示siRNA浓度为50nM时对细胞的抑制率为78.14±2.59%,且平均荧光强度(MFI)为96.43±3.62。siRNA浓度为100nM时对细胞的抑制率为93.37±3.36%,MFI为125.15±2.73。将两个浓度的siRNA叠加后可以看出,100nM的siRNA转染后峰值后移,荧光强度大,对细胞的抑制效果优于50nM的siRNA。(2) Real-time PCR方法检测转染后SRPK1的表达通过荧光定量PCR方法检测基因表达可以看出试剂组表达量高,说明转染试剂细胞毒性小,无关序列的对照siRNA对SRPK1的表达无明显影响。合成的三条SRPK1-siRNA序列s1,s2,s3均可以抑制SRPK1的表达。s2与s3的效果优于s1,且浓度为100nnM时优于50nM。(3)MTT方法检测细胞增殖试剂组和无关序列对照组对细胞的抑制率最低。试剂组在细胞培养48小时时对细胞的最大抑制率为9.65±1.98%,对照组100nM培养48小时时抑制率最高为11.49±1.02%。合成的三条SRPK1-siRNA对细胞的抑制均有明显增加。其中s2序列的效果最好,其次为s3序列。s2和s3序列对细胞的抑制率在100nM浓度时优于50nM。s3序列在100nM培养48小时抑制率为44.88±3.87%,同样时间和浓度的s2序列的抑制率为49.62±4.33%,为最高。培养72小时后抑制率较前均有下降。s3序列100nM培养72小时抑制率为38.68±2.57%,s2序列在相同时间和浓度也较前下降为42.14±2.94%。综上所述,s2及s3序列的抑制细胞增殖效果优于s1,且100nM时优于50nM浓度的siRNA。(4)细胞周期检测通过之前Real-time PCR实验和MTT实验结果,我们选择合成SRPKl-siRNA的s2和s3序列且浓度为1OOnM做为实验1组和实验2组。通过细胞周期变化可以看出,对照1组和2组,处于S期的细胞分别为53.93±3.15%和54.74±4.26%均高于两个实验组处于S期的细胞43.82±2.61%和44.32±3.52%。且实验1组和2组处于S期的细胞无明显差别。四组细胞周期图中CV值偏少,说明变异率小,结果准确。2.抑制SRPK1表达对白血病K562细胞凋亡的影响(1)流式细胞术检测细胞凋亡通过第一部分研究Real-time PCR实验和MTT实验结果,我们选择合成SRPK1-siRNA的s2和s3序列且浓度为100nM做为实验1组和实验2组。通过细胞凋亡的散点图可以看出对照1组和对照2组,凋亡细胞百分比偏少,分别为2.09±1.98%和3.14±2.16%。且处于早期凋亡的细胞也偏少,分别为5.01±2.36%和5.47±1.83%。实验组凋亡的细胞明显增加。s2干扰序列凋亡的细胞29.95±3.27%,早期凋亡细胞为15.13±4.02%,s3干扰序列凋亡的细胞31.4±2.85%,早期凋亡细胞为15.93±3.52%。s3序列对细胞凋亡的效果好于s2序列。(2) Western Blotting检测凋亡相关蛋白对照和实验组分组同上。Caspase3蛋白的表达在四组之间无明显差异,但Cleaved caspase3实验组和对照组有明显差异。其中s3的灰度值最高,说明表达量最多。PARP与内参指数P-actin比较无明显差异,实验组较对照组略有下降,无统计学意义。然而Cleaved PARP的表达,实验组较对照组明显增加。实验2组的灰度值最高,表达增加。抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax组合,实验组较对照组明显下降,且两实验组之间比较无明显差异。研究结论：1.采用siRNA技术对SRPK1基因进行干扰,使其沉默,可以减少K562细胞的增殖。我们合成的小干扰RNA序列s2和s3效果明显,可以进行下一步实验,检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达。2.通过siRNA干扰SRPK1表达后,启动了细胞的凋亡。凋亡相关蛋白检测发现,细胞凋亡的效应蛋白caspase3、PARP被启动,抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax明显降低,促使细胞发生凋亡。