背景肝癌之所以是人类难治性的恶性肿瘤,与肝脏的解剖学特点相关。肝癌可以在极早期就出现肝内的广泛转移或者肝外转移,而上皮间质转化(EMT)是恶性肿瘤侵袭转移的始动环节。因此研究肝癌的生物学行为的调控机制极为重要,尤其是EMT的调控机制更为重要。在我们的前期研究中发现:lncRNAH19、miR-15b、及CDC42在肝癌中异常表达,通过生物学软件发现这三者可能存在着相关的调控位点。因此本课题从临床肝癌标本、肝癌细胞株入手研究这三者的表达状况、与临床病理特点之间的关系,以及在细胞系水平的调控机制,为进一步探索其调控肝癌生物学行为和EMT进程的机制打下一定的基础。第一部分:lncRNAH19、miR-15b和CDC42在肝癌中的表达及关系分析目的 探讨lncRNAH19、miR-15b和CDC42在人肝癌组织及癌旁组织、人肝癌细胞株及正常肝细胞株中的表达差异:探讨lncRNAH19、miR-15b和CDC42在肝癌组织中表达的相关性及潜在临床意义。方法 收集46例人肝癌组织及配对癌旁组织,取对数生长期多种肝癌细胞株和人正常肝细胞株,Trizol法提取Total RNA,采用特异性反转录引物反转录制备cDNA。根据Genebank中的lncRNA H19和miR-15b的全序列,设计针对lncRNA H19和miR-15b的PCR检测引物,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA H19和miR-15b的表达水平。取对数生长期多种肝癌细胞株及人正常肝细胞株,提取细胞总蛋白,BCA法行蛋白定量,Western blot检测CDC42蛋白含量。对46例肝癌组织及配对癌旁组织行免疫组织化学检测CDC42蛋白表达情况。分析lncRNA H19、miR-15b和CDC42在人肝癌组织及癌旁组织、人肝癌细胞株及正常肝细胞株中的表达差异;进一步探讨lncRNAH19、miR-15b和CDC42在肝癌组织表达的相关性及其与肝癌患者临床病理特征的关系。结果 QRT-PCR检测显示,lncRNA H19在人肝癌组织及细胞株中高表达(与癌旁组织和人正常肝细胞株比较,p<0.05);miR-15b在人肝癌组织及细胞株中低表达(与癌旁组织和人正常肝细胞株比较,p<0.05);Western blot结果显示:CDC42蛋白则在人肝癌细胞株中高表达(与人正常肝细胞株比较,p<0.05)。免疫组织化学结果显示:CDC42蛋白在人肝癌组织中高表达(与癌旁组织比较,p<0.05)。我们发现lncRNAH19在50.0%(23/46)的肝癌组织中高表达,而在32.6%(15/46)的肝癌组织中低表达;miR-15b在47.8%(22/46)的肝癌组织中低表达,而在30.4%(14/46)的肝癌组织中高表达;CDC42在54.3%(25/46)的肝癌组织中高表达,而在19.6%(9/46)的肝癌组织中低表达。进一步的统计分析显示lncRNAH19的表达水平与病灶数目(χ2=9.698,P=0.002)与分化程度(χ2=4.934,P=0.026)相关,而与年龄、性别、AFP水平、肿瘤大小、门静脉癌栓及AJCC分期等特征无明显相关(P>0.05);miR-15b的表达水平与病灶数目(χ2=7.066,P=0.008)相关,而与年龄、性别、AFP水平、肿瘤大小、门静脉癌栓、分化程度及AJCC分期等特征无明显相关(P>0.05);CDC42的表达水平与AJCC分期(χ2=5.275,P=0.022)与分化程度(χ2=5.100,p=0.024)相关,而与年龄、性别、AFP水平、门静脉癌栓、肿瘤大小及病灶数目等特征无明显相关(P>0.05)。结论 lncRNAH19和CDC42在人肝癌组织及细胞株中高表达,miR-15b在人肝癌组织及细胞株中低表达。lncRNAH19表达水平和CDC42呈正相关,而miR-15b表达水平与lncRNAH19和CDC42呈负相关。lncRNAH19、miR-15b和CDC42的表达水平与肝癌病灶数目、分化程度或者AJCC分期相关。第二部分:lncRNAH19、miR-15b和CDC42之间调控关系分析目的 分析lncRNA H19和miR-15b、miR-15b和CDC42之间的调控关系。方法 生物信息学软件预测lncRNA H19与miR-15b、miR-15b与CDC42之间可能存在的结合位点。分别合成miR-15b mimics和miR-15b inhibitor;设计合成针对lncRNAH19 的短发夹 RNA,并克隆至 pSicoR 质粒载体(shH19)。将 shH19、miR-15b mimics、miR-15b inhibitor 分别转染 HepG2 和 Bel-7402 细胞株,qRT-PCR 检测转染前后细胞 lncRNA H19、miR-15b 和 CDC42 mRNA 表达水平。将 H19、CDC42 3’UTR区及其突变体克隆到萤光素酶载体psiCHECK-2中,构建H19、CDC42 3’UTR区野生型和突变型质粒。将H19、CDC42 3’UTR区野生型和突变型重组质粒分别与miR-15b mimics、miR-15b inhibitor、miR-15b mimics 阴性对照或 miR-15b inhibitor 阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性,从而对lncRNAH19和miR-15b、miR-15b和CDC42的之间的靶向调节关系进行验证。结果生物信息学软件发现lncRNA H19与miR-15b、miR-15b与CDC42 3’UTR区存在潜在结合位点。shH19转染HepG2和Bel-7402细胞后,lncRNA H19、CDC42mRNA的表达水平较空白对照和阴性对照组显著下降,而miR-15b表达水平较空白对照和阴性对照组明显增加(p<0.05)。miR-15b mimics转染HepG2和Bel-7402细胞后,CDC42 mRNA的表达水平较空白对照和阴性对照组显著下降,miR-15b表达水平较空白对照和阴性对照组显著增加(p<0.05);而miR-15b inhibitor转染HepG2和Bel-7402细胞后,CDC42 mRNA的表达水平较空白对照和阴性对照组显著增加,miR-15b表达水平较空白对照和阴性对照组明显降低(p<0.05)。双萤光素酶报告基因检测系统显示,miR-15b mimics分别与H19野生型和突变型重组质粒共转染293T细胞后,H19野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显降低(p<0.05);miR-15b inhibitor分别与H19野生型和突变型重组质粒共转染293T细胞后,H19野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显增加(p<0.05)。而miR-15b mimics分别与CDC423’UTR野生型和突变型重组质粒共转染293细胞后,CDC42 3’UTR区野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显降低;miR-15b inhibitor分别与CDC42 3’UTR野生型和突变型重组质粒共转染293T细胞后,CDC42 3’UTR野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显增加(p<0.05)。而 miR-15b 模拟物、miR-15 binhibitor 对 H19 突变型、CDC423’UTR突变型萤光素酶活性无明显影响(p>0.05)。结论 lncRNAH19能靶向结合miR-15b,CDC42为miR-15b的靶基因。在肝癌细胞中,H19可以通过靶向调控miR-15b的表达而上调CDC42的表达。第三部分:lncRNAH19/miR-15b/CDC42信号轴对肝癌细胞生物学行为的影响目的 构建不同lncRNAH19、miR-15b表达水平的细胞模型,探讨其对CDC42表达水平的影响及对细胞增殖、侵袭迁移和凋亡生物学进程的影响。方法 分别用 shH 19、miR-15b mimics、miR-15b inhibitor 和 shH19/miR-15b inhibitor 复合物脂质体转染 Bel-7402、HepG2 细胞,qRT-PCR、Western blot 检测转染前后细胞CDC42mRNA及蛋白表达水平;此外,通过平板克隆实验、划痕试验、Transwell实验和细胞凋亡实验观察转染前后细胞增殖、侵袭迁移和凋亡等生物学行为的改变。结果 shH19、miR-15b mimics转染后,细胞增殖、侵袭迁移能力和CDC42表达水平较空白对照组明显降低,而凋亡能力明显增加(p<0.05);miR-15b inhibitor转染后,细胞增殖、侵袭迁移能力和CDC42表达水平显著升高,而凋亡能力明显降低(p<0.05)。此外shH19/miR-15b inhibitor复合物转染肝癌细胞后,细胞增殖、侵袭迁移能力和CDC42表达水平较shH19单转染组明显增加,而细胞凋亡能力明显降低(p<0.05)。结论 miR-15b inhibitor可逆转shH19介导的肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡生物学行为的改变。lncRNAH19可通过靶向调控miR-15b/CDC42信号轴而参与肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡生物学进程。第四部分:lncRNAH19通过miR-15b/CDC42信号轴调控肝癌细胞EMT进程的初步研究目的:探讨lncRNAH19/miR-15b/CDC42信号轴在肝癌EMT进程中的作用。方法:分别用 shH19、miR-15b mimics、miR-15b inhibitor 和 shH19/miR-15b inhibitor复合物脂质体转染Bel-7402、HepG2细胞,qRT-PCR检测转染前后细胞CDC42、PAK1及EMT相关基因mRNA的表达情况;Western blot检测转染前后细胞CDC42、p-PAK1及EMT相关蛋白表达情况。对46例肝癌组织及其配对癌旁组织行qRT-PCR、Western blot检测,分析EMT相关基因及蛋白表达情况及其与lncRNAH19表达水平的相关性。结果:shH19 和 miR-15b mimics 转染后,细胞 CDC42、PAK1、N-cadherin、Vimentin mRNA和CDC42、p-PAK1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平较空白对照组明显降低,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较空白对照组明显增高(p<0.05);miR-15b inhibitor 转染后,细胞 CDC42、PAK1、N-cadherin、Vimentin mRNA和CDC42、p-PAK1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平较空白对照组明显增加,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较空白对照组明显降低(p<0.05);此外shH19/miR-15b inhibitor 复合物转染后,细胞 CDC42、PAK1、N-cadherin、Vimentin mRNA 和 CDC42、p-PAK1、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平较 shH19 单转染组明显增加,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较shH19单转染组明显降低(p<0.05)。与癌旁组织相比,肝癌组织中E-cadherin mRNA和蛋白表达水平明显降低,而N-cadherin和Vimentin表达水平明显增加(p<0.05)。Spearman相关性分析发现:肝癌组织中H19表达水平与E-cadherin表达水平呈负相关,而与N-cadherin和Vimentin呈正相关。结论:miR-15b inhibitor可逆转shH19介导肝癌细胞EMT相关蛋白的调控作用。lncRNA H19可通过靶向miR-15b活化CDC42/PAK1信号通道而促进肝癌细胞EMT进程。lncRNA H19可通过miR-15b/CDC42信号轴参与肝癌EMT进程。