论文一HOXD13基因p.Q317R突变和多聚丙氨酸延展突变的功能研究肢体畸形在新生儿中发生率为1‰-2‰,可单独出现也可作为综合征的一种表型。非综合征型并指（趾）畸形是人类最常见的肢端畸形,多为常染色体显性遗传。Temtamy与McKusick按临床表现将非综合征型并指（趾）分为五种类型。HOXD13 N端多聚丙氨酸延展突变可以导致Ⅱ型并指（趾）,也称为并多指（趾）（synpolydactyly,SPD）（MIM 186000）,主要临床表现为手部第3、4指并指,足部第4、5趾并趾,常伴蹼中全部或部分多指（趾）。前期工作中,本课题组在一个V型并指（MIM 186300）家系中首次鉴定出HOXD13同源盒结构域突变p.Q317R,主要临床表现为第4、5掌骨融合。本研究对HOXD13同源盒p.Q317R点突变和多聚丙氨酸延展突变进行功能研究,探索这两种突变导致不同并指（趾）畸形的分子机制。第一部分HOXD13同源盒p.Q317R点突变的功能分析同源盒基因（homeobox genes,Hox genes）编码一个高度保守的转录因子家族,在决定胚胎期细胞的定向分化与增殖以及调控机体组织器官的发育过程中起关键性作用。人类含有39个HOX基因,形成4个基因簇（HOXA-HOXD）,分布在4条染色体上。Hox基因有2个外显子,第1外显子编码N端结构域,目前对Hox蛋白N端结构域的功能尚不清楚。第2外显子编码高度保守的同源盒结构域（homeodomain,HD）,是Hox蛋白的DNA结合结构域,HD由60个氨基酸组成,其中第47,50,51位氨基酸在HD与DNA亲和力及识别特异性方面发挥重要作用。5’Hoxa及Hoxd基因（Hoxa9-13,Hoxd9-13）在肢体发育中起重要作用,Hoxa13及Hoxd13基因主要调控端骨（手、足）发育。人HOXD13及HOXA13基因突变均导致先天性肢端发育异常。目前发现的导致人类肢端发育畸形的HOXD13基因突变包括N端多聚丙氨酸延展突变导致的典型并多指（趾）畸形;点突变及缺失突变导致的非典型并多指（趾）畸形或短指畸形。HOXD13 p.1314L点突变使同源盒结构域第47位异亮氨酸变为亮氨酸（147L）,导致的肢端畸形为E型短指,主要畸形为双手及双脚对称性短指。前期工作中,本课题组在一个中国汉族V型并指家系中首次鉴定出HOXD13 p.Q317R点突变,主要畸形为第4、5掌骨融合。该突变导致同源盒结构域第50位谷氨酰胺变为精氨酸（Q50R）。Q50在同源盒结构域与DNA的亲和力及识别特异性方面发挥重要作用,替换为碱性精氨酸后可能会改变HOXD13对DNA的亲和力及识别特异性。目前对受HOXD13调控的下游基因知之甚少,EphA7是较为明确直接受Hoxd13转录调节的下游基因。EphA7是ephrin的A型受体之一,Eph受体及其配体ephrin在胚胎组织广泛表达,调节心血管及神经系统的发育、轴突导向、组织分化等多个发育过程。最近一些研究提示Eph-ephrin信号通路在肢芽发育过程中同样发挥重要作用。为研究HOXD13 p.Q317R突变体对人EPHA7基因转录活性的影响,我们构建了HOXD13野生型及p.Q317R、p.1314L表达载体,并将EPHA7基因启动子区660bp片段（-580～+80）克隆至萤火虫荧光素酶报告基因载体（pGL3-Basic）,将HOXD13表达载体、报告基因载体及海肾荧光素酶载体共转染小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2后,检测相对荧光素酶活性。结果显示,与野生型HOXD13蛋白相比,p.Q317R突变体对EPHA7启动子的转录激活作用明显降低,下降至野生型的13%,而p.1314L突变体对EPHA7启动子的转录激活作用也降低,但降低程度没有p.Q317R明显,为野生型的63%。为了检测p.Q317R及p.1314L两种突变体对EphA7启动子的结合能力,我们将两种突变体及野生型HOXD13表达载体分别转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,通过染色质免疫沉淀（ChIP）法富集HOXD13蛋白结合的DNA片段,PCR扩增EphA7启动子区Hoxd13结合位点所在DNA片段,电泳观测产物浓度。初步实验结果显示,两种突变体富集到的DNA片段量之间没有明显差别,但均少于野生型的富集量,提示两种突变体对EphA7启动子的结合能力均降低,但两种突变体之间差别不明显。以上结果提示:HOXD13 p.Q317R导致V型并指的可能分子机制之一是突变蛋白与EPHA7启动子结合能力下降,对EPHA7基因转录激活能力降低,进而影响EPHA7基因表达。此外,我们的结果还提示p.Q317R突变体对EPHA7基因转录激活能力的丧失程度比p.1314L突变体更严重,为阐明这两种同源盒结构域点突变导致不同肢端畸形的致病机制提供了依据。为进一步研究HOXD13 p.Q317R突变体的功能及其导致V型并指（趾）的致病机制,我们成功构建了针对此点突变的小鼠Hoxd13 Q50R置换型基因打靶载体,为建立此点突变的小鼠模型奠定了基础。第二部分HOXD13多聚丙氨酸延展突变的功能分析多聚丙氨酸延展（polyalanine expansion,PAE）是近年来发现的一种新的致病突变,目前已发现PAE导致9种人类先天发育畸形。HOXD13第1外显子编码的蛋白N端有一个多聚丙氨酸链,含15个丙氨酸,当延长至22-29个时导致SPD,即Temtamy和McKusick分类中的Ⅱ型并指（趾）（syndactyly typeⅡ）。对患者表型与基因型分析结果显示,SPD的严重程度与HOXD13多聚丙氨酸延展的长度相关,多聚丙氨酸数目增加越多,肢端畸形越严重。HOXD13蛋白N端功能、多聚丙氨酸的作用及多聚丙氨酸延展突变的致病机制尚不十分清楚。对5’Hoxd基因（Hoxd11-13）敲除鼠及自发Hoxd13多聚丙氨酸延展突变鼠（synpolydactly homolog,spdh）的研究提示,Hoxd13多聚丙氨酸延展突变具有显性负效应（dominant negative）,即突变体能够影响野生型Hoxd13及其它5’Hoxd蛋白的功能。Hox蛋白通过同源盒结构域与DNA结合,识别序列比较简单。在胚胎发育过程中,Hox蛋白实现时间特异性及组织特异性基因表达调控功能的机制之一是与不同的辅助因子相结合。研究发现,多种Hox蛋白与TGF-β通路中的胞内信号分子Smad蛋白相互作用,互为转录辅助因子,调节下游基因的表达。Smad蛋白由N端的MH1结构域、C端的MH2结构域及接头区构成。MH1结构域能够结合DNA,MH1及MH2结构域都可以与其它蛋白相互作用,调节Smad蛋白的转录活性。目前发现的能够与Hoxd13相互作用的Smad蛋白为Smad1、2和5。BMPs是TGF-β配体超家族的成员,Smad1、5和8是BMPs通路的胞内信号分子。BMPs信号通路在胚胎肢芽发育过程中发挥重要作用,参与调控肢芽生长、软骨形成及分化、指（趾）形成、指（趾）间组织的凋亡等过程。而HOXD13在胚胎肢端发育过程发挥重要作用,也参与上述发育过程,提示HOXD13与SMAD蛋白相互作用可能是二者发挥功能的重要机制。为研究多聚丙氨酸延展突变是否影响HOXD13与SMAD蛋白的相互作用,我们将各种HOXD13多聚丙氨酸延展及缩短突变体克隆入酵母双杂交载体中的BD载体（pGBKT7）,与酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域形成融合蛋白,并将SMAD1的MH2结构域克隆入AD载体（pGADT7）,与GAL4的转录激活结构域形成融合蛋白,将各种BD载体及AD载体分别转化酵母AH109后,利用酵母双杂交检测HOXD13多聚丙氨酸延展及缩短型突变体与SMAD1 MH2结构域的相互作用情况。观察酵母表型后发现,多聚丙氨酸缩短突变体并不影响HOXD13-SMAD1 MH2相互作用,而多聚丙氨酸延展突变体+9A,+14A不能与MH2结构域相互作用,+7A与MH2相互作用能力减弱。此外,我们还对上述转化子进行了α半乳糖苷酶活性定量检测,结果显示,与野生型HOXD13相比,多聚丙氨酸延展突变体与SMAD1 MH2转化组的α半乳糖苷酶活性降低,并且随丙氨酸数目增多,α半乳糖苷酶活性减弱,提示多聚丙氨酸延展突变体与SMAD1 MH2的相互作用减弱,并且相互作用的减弱程度与多聚丙氨酸延展的数目相关,与酵母表型实验结果一致。为了在哺乳动物细胞内验证酵母双杂交的实验结果,我们将全长SMAD1编码区克隆入哺乳动物双杂交载体中的BD载体（pBIND）,与GAL4的DNA结合结构域形成融合蛋白;将野生型及各种多聚丙氨酸延展HOXD13编码区分别克隆入哺乳动物双杂交载体中的AD载体（pACT）,与转录激活结构域VP16形成融合蛋白。将上述AD、BD载体及含GAL4结合位点的荧光素酶报告基因载体（pG51uc）分别共转染HeLa细胞后,检测相对荧光素酶活性。结果显示,多聚丙氨酸延展突变与SMAD1转染组相对荧光素酶活性降低,并且随丙氨酸数目增多,荧光素酶活性减弱,提示多聚丙氨酸延展突变体与SMAD1相互作用减弱,并且相互作用的减弱程度与多聚丙氨酸延展的数目相关,与酵母双杂交实验结果一致。为进一步缩小HOXD13与SMAD1 MH2相互作用的氨基酸范围,我们将6种HOXD13截短突变体,编码的氨基酸范围分别为1-71、72-264、72-167、168-264、136-200和266-335（全长HOXD13具有335个氨基酸）,分别克隆入BD载体,利用酵母双杂交检测上述突变体与SMAD1 MH2的相互作用情况。结果显示,二者相互作用的最小范围为168-200,不包括多聚丙氨酸区域。这一结果提示多聚丙氨酸延展突变可能通过改变蛋白的构象影响HOXD13与SMAD1相互作用。为了研究HOXD13-SMAD相互作用是否调节SMAD下游基因的表达及多聚丙氨酸延展突变是否影响上述过程,我们构建了各种HOXD13多聚丙氨酸延展突变的表达载体,与Smad3/4应答性荧光素酶报告基因载体pGli3ti-（SBE）₄共转染人HepG2肝癌细胞,经TGFβ-1诱导后,检测相对荧光素酶活性。结果显示,野生型HOXD13能够抑制TGFβ-1诱导的SMAD3/4的转录激活作用,而多聚丙氨酸延展突变体的抑制作用减弱,并且多聚丙氨酸数目越多,抑制作用的减弱程度越明显。共转染实验还表明,多聚丙氨酸延展突变体并不影响野生型HOXD13对SMAD转录活性的抑制作用。以上结果提示多聚丙氨酸延展突变可能通过影响蛋白的局部构象限制HOXD13与SMAD1及其它SMAD蛋白的相互作用程度,导致HOXD13蛋白丧失对SMAD蛋白的转录抑制功能,引起BMP通路的下游基因表达失控。推测HOXD13多聚丙氨酸延展突变在一定程度上是“失去功能”性突变,导致野生型HOXD13蛋白的单倍体不足（haplotype insufficiency）。以上结果为阐明HOXD13多聚丙氨酸延展突变体导致SPD的分子机制提供了实验依据,并为进一步了解HOXD13 N端功能及多聚丙氨酸的作用提供新线索。论文二X连锁无汗/少汗型外胚层发育不良中EDA基因致病突变鉴定X连锁隐性无汗/少汗型外胚层发育不良（X-linked anhidrotic/hypohidroticectodermal dysplasia,XLHED;MIM305100）是无汗/少汗型外胚层发育不良（anhidrotic/hypohidrotic ectodermal dysplasia,EDA）中最常见的一种,约占95%。XLHED的典型临床表现为毛发、牙齿及汗腺发育不良三联征。XLHED的致病基因为EDA,定位于染色体Xq12.2～q13.1。EDA基因含有12个外显子,通过选择性剪接产生不同的转录本,编码多种肿瘤坏死因子相关家族信号分子,其中最长的转录本由8个外显子转录而成,编码ectodysplasin-A蛋白。Ectodysplasin-A蛋白具有391个氨基酸残基,是肿瘤坏死因子家族成员,介导胚胎发育早期上皮细胞与间叶细胞的相互作用。目前已发现100多种EDA基因致病突变可导致XLHED,包括点突变（错义突变、无义突变、剪接位点突变）、微小缺失及插入、大范围缺失。目前对XLHED的治疗仅限于对症治疗,为XLHED家系开展基因诊断及遗传咨询,对女性携带者进行产前基因诊断是预防患儿出生的有效方法。我们收集了7个临床确诊的XLHED家系,获得知情同意后采集家系成员外周血,常规酚/氯仿法提取基因组DNA,设计引物,PCR扩增EDA基因各外显子及外显子-内含子交界处,产物纯化后直接测序。在6个家系中鉴定出5个致病突变,4个为点突变,1个为第3外显子缺失突变。其中3个点突变（p.M1T、p.L62P和p.G195E）为国际首次报道的新突变。采用PCR产物酶切的方法,在各家系全部成员及100名正常女性对照个体中对上述新突变进行了验证。为确定缺失突变家系中患者第3外显子缺失的范围,在EDA基因第3外显子上游5kb、7.5kb和10kb及下游10kb、20kb、25kb和30kb处分别设计引物,扩增患者的相应位置基因组片段,从而将缺失范围初步确定在第3外显子上游7.5kb至下游30kb。进一步利用Gap-PCR将缺失范围确定为36kb。我们对Gap-PCR产物测序,并与基因组正常序列进行比对后,发现缺失产生的分子机制是位于第3外显子两侧的2个LINE1元件发生不等同源重组（unequal homologous recombination）。此外,我们通过对胚胎绒毛基因组DNA进行单体型分析及基因测序的方法,为3名怀孕携带者的胎儿进行了产前基因诊断。结果证明,2名胎儿为未携带致病基因的男性胎儿,1名为携带致病基因的男性胎儿。上述研究结果不仅丰富了EDA基因致病突变谱,还首次发现LINE1元件介导的不等同源重组是导致XLHED的致病机制。