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京尼平是一种环烯醚萜类无毒物质,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂,是栀子中起主要药效作用的重要成分,对抗炎、治疗肝脏疾病、抗脂质过氧化、降压、缓解Ⅱ型糖尿病症状、抗NO生成、通便等具有良好效果。它同时是一种优良的天然生物交联剂,具有生物相容性好、细胞毒性小、抗降解能力强和应用领域广泛等优点。京尼平在自然界中的含量很少。据报道,栀子中京尼平的含量仅为0.005％～0.01％左右,因此直接提取十分困难。目前的制备方法一般采用酶解法,即利用β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷生产京尼平,但由于其成本较高,从而限制了它的应用,未能实现工业化生产。而微生物发酵法通过常温、常压条件下微生物的发酵直接实现京尼平苷的转化,不仅能够避免酶法生产需要提纯京尼平苷及酶的缺陷,同时最大限度的保护有效成分免遭破坏,有利于简化生产工艺,降低生产成本,提高产率。本文研究了微生物发酵法生产京尼平的整个工艺流程,包括菌种的选育、发酵及转化条件的优化和产物的分离纯化,为京尼平的工业化生产提供一条切实可行的途径。
本论文的主要研究内容及结果如下:
1.从土壤中经过初筛、复筛得到一株产β-葡萄糖苷酶的菌株FYS-9,经形态观察及18S Rdna序列比对分析,鉴定为泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。
2.以:FYS-9为出发菌株,通过紫外及原生质体诱变,筛选得到一株酶活力较FYS-9提高近39.4％的突变株70C-3。对70C-3产酶培养基进行了优化,并研究了其β-葡萄糖苷酶的酶学性质,确定了其产酶发酵培养基配方为:麸皮+玉米芯(1:1)3％,(NH4)2SO40.5％,KH2PO40.2％,吐温800.1％,MgSO4·7H2O0.05％,微量离子液1.5 Ml/L。通过该培养基发酵产β-葡萄糖苷酶酶活达到45.16 IU/Ml。且其所产酶的最适温度为60℃,最适Ph为5.0。
3.发酵生产京尼平条件的优化。确定最佳转化条件为:以京尼平苷为反应底物时,30℃,150 r/min,添加京尼平苷1.5％转化24 h,京尼平苷的转化率达到97.7％,京尼平的含量达8.5 g/L;经测定栀子粉中京尼平苷的含量为6.738％。以栀子粉直接发酵时,6％栀子粉,于30℃,170 r/min条件下接种发酵培养96 h,京尼平苷的最大转化率达116.36％。
4.选取H-103大孔树脂吸附京尼平,上柱液流速为2 Ml/min,以60％乙醇水溶液作为洗脱剂,经重结晶纯化后获得纯度达98.2％的京尼平,整个工艺收率为77.8％。后经HPLC,MS,NMR,IR鉴定产物为京尼平。