链黑菌素（streptonigrin， STN,1）是一个由绒毛链霉菌（Streptomyces flocculus）产生的具有独特的氨基喹啉醌式结构的抗肿瘤抗生素。链黑菌素与和具有类似结构和活性的链黑菌酮（streptonigrone，2），淡紫醌霉素（lavendamycin，7）以及其他四个天然的结构类似物构成了一个抗生素家族，命名为“streptonigrinoids”。链黑菌素由四个环构成，其中三个环共处于一个平面，第四个环则与这个平面垂直。链黑菌素具有多种生物活性，包括广谱的抗菌和抗病毒活性，最重要的是它具有广谱的抗肿瘤活性，尤其对急性白血病、恶性淋巴瘤及其他骨髓增生性疾病均有较好的疗效。链黑霉素抑制肿瘤的机制有多种，它可以抑制DNA和RNA的生物合成，诱导DNA单链或双链断裂，诱导DNA的非程序化合成及与DNA形成复合体，抑制DNA拓扑异构酶II。然而，链黑霉素具有较为明显的骨髓抑制副作用，限制了其在临床上的广泛应用。因此，链黑菌素吸引了化学家和生物学家的极大关注，化学家通过全合成方法合成了多种链黑菌素类似物期望能够降低其毒性以利于临床应用。有关链黑菌素生物合成的早期研究集中于利用同位素喂养实验揭示了链黑菌素的生物来源，而仍无法企及其生物合成的分子机制。我们利用基因组测序技术获得了链黑菌素产生菌基因组序列，以苯丙氨酸β-碳甲基转移酶MppJ为探针，筛选到了链黑菌素的生物合成基因簇并通过大片段缺失实验予以证实。我们利用基因敲除确定了以stnA为上边界和stnT4为下边界，含有48个基因的链黑菌素生物合成基因簇。生物信息学分析揭示该基因簇含有四个SAM依赖的甲基转移酶基因，四个亮氨酸羧甲基转移酶基因（LCM），十三个氧化还原酶基因，四个参与合成3-羟基安息香酸的基因，以及多个调控、抗性和未知功能基因。我们对基因簇中的21个基因进行了敲除，分离鉴定了11个链黑菌素生物合成中间体或类似物。stnA基因的失活菌株积累了3，4和5三个链黑菌素结构类似物，并通过喂养实验证实这三个化合物是链黑菌素的生物合成中间体。突变株stnT4和stnF3-4积累化合物6，喂养实验证实6同样能回补链黑菌素的产生，推测其为水解酶StnA催化3水解的产物。stnB1编码芳香环双氧化酶的-亚基，其突变株stnB1积累淡紫醌霉素7及其甲酯8，此外，HPLC分析显示β-咔啉碱oxapropaline D15在该突变株中的产量比原始菌株有所提高。喂养实验证实7和8能够参与链黑菌素的生物合成而15不能，由此可以证实淡紫醌霉素7及其甲酯8是链黑菌素的生物合成中间体，而15可能是链黑菌素生物合成途径中非程序性脱酸形成的副产物。在电子供体联亚硫酸钠存在下，我们利用StnB1及芳香环双氧化酶的-亚基StnB2在体外实现了7和8的氧化开环形成化合物9和10，初步证实了芳环双氧化酶StnBs负责吲哚环N-C8键的开环和双羟基化。此外，化合物7和8的共底物生化研究表明，化合物8可能是StnBs体系的最适底物。根据以上的喂养实验和生化研究，我们初步推测淡紫醌霉素7经甲酯化形成8，然后在芳环双氧化酶StnBs催化下开环形成链黑菌素生物合成的直接前体。stnF1-F4编码亮氨酸羧甲基转移酶。在这四个基因的敲除突变菌株中，只有stnF1丧失了链黑菌素的生产， stnF2仍产生少量的链黑菌素， stnF3-4均积累化合物6及微量链黑菌素。据此，我们推测StnF1或者StnF2可能负责了淡紫醌霉素7的甲酯化形成化合物8,并通过生化实验证实是StnF2而不是StnF1负责了7的甲酯化。我们还完成了四个编码SAM依赖的甲基转移酶基因的敲除。从编码碳甲基转移酶基因stnQ1的失活突变菌株中，我们分离鉴定了3-去甲基链黑菌素13；stnQ2的失活完全终止了链黑菌素的生产；stnQ3的失活突变菌株积累了化合物11，6-甲氧基化的化合物10；我们从stnQ4的失活突变菌株的发酵液中分离鉴定了10-去甲基链黑菌素12。然而喂养实验表明11不是链黑菌素生物合成的中间体，可能是一个副产物。此外，我们完成了其他4个基因的突变失活，这些突变菌株或者不影响链黑菌素的生产，或者中断了链黑菌素的生产，但不积累任何与链黑菌素生物合成相关的化合物，那么这些基因编码的酶蛋白催化的反应可能位于链黑菌素生物合成途径的早期阶段。基于对基因簇各基因的生物信息学分析，结合突变菌株所积累的化合物的结构分析，相应化合物的喂养实验及关键步骤的生物化学研究，我们推测了链黑菌素的生物合成途径。这为阐明链黑菌素生物合成途径，揭示途径中所蕴含的新颖酶催化反应的分子酶学机制，和利用遗传学、酶学及有机化学多学科的原理和技术创造链黑菌素的类似物，以期获得活性更好，毒性降低的药物奠定了基础。