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木材作为主要的建筑、家具和生物质能源材料，广泛应用于工业生产与人类生活。木材主要由茎的次生木质部发育而来，而在细胞层面上则主要由植物细胞壁组成。而植物细胞壁则主要由初生壁和次生壁组成，其中次生壁积累的生物质占植物生物质总量的绝大部分，所以理解和研究植物次生细胞壁生物合成机理，不仅对植物次生发育的基础研究具有重要的科学意义，而且为选育符合人类生产和生活所需的林木新品种打下坚实的基础。
近十年的研究发现，多种转录因子、microRNA和关键酶基因参与调控了次生壁的生物合成，其中研究比较清楚的是次生壁生物合成是由一个复杂的多级转录调控网络所调控。该调控网络中，众多的NAC和MYB家族转录因子参与其中。其中NAC转录因子作为一级主开关基因通过结合SNBE(Secondary wall NAC binding element)位点，可直接调控下游基因的表达，或通过激活二级主开关MYB转录因子，进而调控下游关键酶基因和细胞程序性死亡相关基因的表达。而MYB转录因子则可以通过SMRE(Secondary wall MYB-responsive element)位点，直接调控下游转录因子或关键酶基因的表达。
杨树作为全球种植最为广泛的速生树种之一，并随着毛果杨(Populus trichocarpa Torr.& Gray )、胡杨(Populus euphratica )和新疆杨(Populus alba var.pyramidalis Bge)等全基因组测序完成，以及多种杨树遗传转化体系的建立，其已成为木本植物研究中的模式植物。现有研究表明，192个杨树R2R3-MYB转录因子中，部分已被证实能够参与调控次生壁的生物合成。但由于杨树次生壁的生物合成过程精细而复杂，必定还有其他转录调控因子参与其中。
本论文通过对杨树R2R3-MYB家族中转录因子进行系统进化树分析和组织表达谱学分析，并结合前期研究报道，筛选出一组可能参与调控次生壁生物合成的转录因子MYB158/189和MYB026/031。根据氨基酸序列比对和序列一致性分析，从中挑选出具有代表性的两个转录因子MYB189和MYB031进行深入研究，结合遗传学、细胞学以及生物化学等多种实验方法，在拟南芥和杨树中对其功能进行深入研究，研究结果如下：
(1)MYB189和MYB031可能通过不同方式调控次生壁的生物合成
MYB189和MYB031在木质部表达较高，说明这两个转录因子可能参与次生壁的生物合成调控。亚细胞定位分析结果显示MYB189和MYB031均定位于细胞核。转录激活结果显示，MYB031为转录激活子而MYB189无转录激活活性，暗示这两个转录因子发挥功能的方式可能有所不同。
(2)MYB189为转录抑制子，主要在茎和根中表达
通过系统进化树分析显示，MYB189属于C49亚家族，与C4抑制子家族亲缘关系相对较远。通过对MYB189与C4抑制子亚家族的基因进行氨基酸序列比对发现，它们仅在N端的R2R3区域比较保守，而在C端差异较大。并且MYB189不具有EAR或TLLLFR等典型的抑制结构域。通过构建MYB189融合激活结构域VP16的表达载体并转化酵母菌株实验证明，MYB189为转录抑制子。为了确定MYB189的抑制结构域，分别构建MYB189不同长度的氨基酸序列片段融合激活结构域VP16的载体，通过酵母转录激活实验和烟草瞬时侵染实验，确定MYB189蛋白的抑制结构域位于C端，序列为：GDDYGNHGMIKKE。为了研究MYB189基因的组织表达特异性，检测其在不同组织中的表达情况，并结合启动子组织表达特异性分析，发现MYB189在杨树茎和根的维管组织中表达水平较高。
(3)在拟南芥中证实MYB189负调控次生壁的生物合成
为了初步研究MYB189基因的功能，首先在拟南芥中过表达MYB189，经过筛选得到转基因纯合体植株。表型观察发现MYB189过表达植株出现倒伏现象。对植株花序轴进行切片分析和组织化学染色，发现过表达植株花序轴中出现维管组织发育迟缓和木质部区域变窄的现象。并且定量结果显示，部分次生壁生物合成关键酶基因在MYB189过表达植株中被下调表达。说明在拟南芥中过表达MYB189负调控次生壁的生物合成。
(4)MYB189负调控杨树茎中次生壁的生物合成
为了研究MYB189转录因子在杨树次生壁生物合成中所发挥的功能，将MYB189过表达载体转化毛白杨(Populus tomentosa)，发现转基因植株生长受到抑制，并出现倒伏现象，同时植株的茎变细，生物量降低。茎组织切片显示，过表达MYB189导致植株的木质部区域变窄，同时纤维细胞细胞壁厚度显著变薄。细胞壁组分含量测定结果显示，转基因植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量均显著降低，说明在杨树中过表达MYB189能够抑制次生壁的沉积。为了明确MYB189对次生壁合成调控的分子机制，对野生型和MYB189过表达植株进行高通量测序分析及定量检测。结果显示，大部分参与次生壁生物合成的关键酶基因及部分相关NAC和MYB转录因子在MYB189过表达植株中被下调表达。此外，还构建了MYB189-RNAi干扰表达载体，转化毛白杨并进行分析。发现转基因植株与野生型相比未呈现显著差异，暗示在杨树基因组中可能存在与MYB189功能冗余的基因。
(5)MYB189可通过SMRE元件直接调控NAC以及下游关键酶基因。
为了深入阐明MYB189调控次生壁生物合成的分子机制，对次生壁生物合成中关键酶基因启动子序列进行分析，发现C4H2、COMT2、GT43B和CesA2B这四个基因的启动子上均含有SMRE结合位点。通过ChIP定量PCR和烟草瞬时侵染实验发现，MYB189可通过结合SMRE位点，直接抑制次生壁生物合成关键酶C4H2、COMT2、GT43B和CesA2B基因的表达。在对MYB189过表达植株高通量测序分析和定量检测中还发现，次生壁调控网络上游多个WNDs开关基因被下调表达。同样对这些基因启动子序列进行分析，发现WND2A和WND2B两个基因的启动子上也均含有SMRE结合位点。烟草瞬时侵染实验及ChIP-qPCR同样证实MYB189可直接结合WND2A和WND2B基因启动子的SMRE位点来抑制其表达。
上述结果表明，MYB189可通过直接抑制WND2A/2B、C4H2、COMT2、GT43B和CesA2B的表达，进而抑制毛白杨次生壁的形成和次生木质部的发育。
(6)MYB031主要在茎的木质部和根中表达
前期研究发现MYB031在木质部中表达最高，暗示MYB031可能参与调控木质部的发育过程。且MYB031为转录激活子，说明MYB031与MYB189可能通过不同的调控方式参与调控次生壁的生物合成。因此对MYB031的功能进行深入研究。组织表达谱分析发现，MYB031主要在木质部中表达。克隆MYB031基因的启动子，在杨树中进行组织表达特异性分析，GUS组织染色发现其主要在茎的木质部和叶片中表达。
(7)过表达MYB031抑制毛白杨中次生壁的生物合成
为了明确MYB031在杨树中所发挥的功能。首先在毛白杨中过表达MYB031，发现转基因植株的生长受到明显的抑制，同时叶片出现不平展以及叶边缘向上卷曲的现象。组织切片及化学染色发现，转基因杨树叶片中叶脉发育异常，叶脉中维管发育受到抑制，叶脉与叶片之间的夹角发生变化，叶片出现不平整的现象。同时过表达MYB031导致毛白杨茎中木质部区域细胞层数减少，纤维和导管细胞壁均变薄。细胞壁组分测定结果显示，MYB031过表达植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量均显著下降。同时对转基因植株进行高通量测序和qRT-PCR分析，结果显示，在MYB031过表达植株中部分木质素、纤维素和木聚糖生物合成关键酶基因的表达量均出现不同程度的下调。同时发现，次生壁调控网络上游部分一级开关调控基因WNDs和二级开关调控基因MYBs被显著下调表达。
(8)降低MYB031的表达促进毛白杨次生壁的生物合成
为了进一步验证MYB031的功能，构建了其RNAi干扰表达载体，并转化毛白杨，发现在MYB031-RNAi转基因植株茎组织的髓部区域出现木质素的异位沉积，并且转基因植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量均有所上升。qRT-PCR结果显示，部分次生壁合成关键酶基因、一级主开关及二级主开关调控基因均上调表达。
(9)MYB031通过与JAZ1相互作用负调控次生壁的生物合成
为了研究MYB031的分子调控机制，通过酵母双杂交文库进行筛选，发现MYB031能够与茉莉酸(Jasmonates，JAs)信号转导途径中的JAZ1(JASMONATE-ZIM-DOMAIN PROTEIN 1)蛋白相互作用，并通过酵母双杂交和BiFC实验进一步证实了两个蛋白在体内和体外均能够相互作用。烟草瞬时侵染实验结果表明，MYB031通过与JAZ1相互作用共同抑制次生壁生物合成主开关基因WNDs启动子的表达。同时，对野生型和MYB031过表达植株进行MeJA处理，茎组织切片及染色结果显示，MYB031过表达植株在MeJA处理后，木质部纤维和导管细胞的细胞壁沉积被抑制的现象明显被消除。综上结果表明，转录激活子MYB031对次生壁沉积的抑制作用依赖于与JAZ1的相互作用。
MYB189和MYB031虽然同在一个亚族，却通过不同的方式负调控次生壁的生物合成。MYB189为抑制子通过直接调控WNDs和次生壁生物合成关键酶基因的表达来抑制次生壁的沉积，而MYB031为激活子通过与JAZ1相互作用来抑制WNDs基因的表达，从而抑制次生壁的沉积。本论文的研究结果为MYB转录因子调控次生壁的生物合成提供了新的作用机制，并进一步丰富了杨树次生壁生物合成调控网络。
近十年的研究发现，多种转录因子、microRNA和关键酶基因参与调控了次生壁的生物合成，其中研究比较清楚的是次生壁生物合成是由一个复杂的多级转录调控网络所调控。该调控网络中，众多的NAC和MYB家族转录因子参与其中。其中NAC转录因子作为一级主开关基因通过结合SNBE(Secondary wall NAC binding element)位点，可直接调控下游基因的表达，或通过激活二级主开关MYB转录因子，进而调控下游关键酶基因和细胞程序性死亡相关基因的表达。而MYB转录因子则可以通过SMRE(Secondary wall MYB-responsive element)位点，直接调控下游转录因子或关键酶基因的表达。
杨树作为全球种植最为广泛的速生树种之一，并随着毛果杨(Populus trichocarpa Torr.& Gray )、胡杨(Populus euphratica )和新疆杨(Populus alba var.pyramidalis Bge)等全基因组测序完成，以及多种杨树遗传转化体系的建立，其已成为木本植物研究中的模式植物。现有研究表明，192个杨树R2R3-MYB转录因子中，部分已被证实能够参与调控次生壁的生物合成。但由于杨树次生壁的生物合成过程精细而复杂，必定还有其他转录调控因子参与其中。
本论文通过对杨树R2R3-MYB家族中转录因子进行系统进化树分析和组织表达谱学分析，并结合前期研究报道，筛选出一组可能参与调控次生壁生物合成的转录因子MYB158/189和MYB026/031。根据氨基酸序列比对和序列一致性分析，从中挑选出具有代表性的两个转录因子MYB189和MYB031进行深入研究，结合遗传学、细胞学以及生物化学等多种实验方法，在拟南芥和杨树中对其功能进行深入研究，研究结果如下：
(1)MYB189和MYB031可能通过不同方式调控次生壁的生物合成
MYB189和MYB031在木质部表达较高，说明这两个转录因子可能参与次生壁的生物合成调控。亚细胞定位分析结果显示MYB189和MYB031均定位于细胞核。转录激活结果显示，MYB031为转录激活子而MYB189无转录激活活性，暗示这两个转录因子发挥功能的方式可能有所不同。
(2)MYB189为转录抑制子，主要在茎和根中表达
通过系统进化树分析显示，MYB189属于C49亚家族，与C4抑制子家族亲缘关系相对较远。通过对MYB189与C4抑制子亚家族的基因进行氨基酸序列比对发现，它们仅在N端的R2R3区域比较保守，而在C端差异较大。并且MYB189不具有EAR或TLLLFR等典型的抑制结构域。通过构建MYB189融合激活结构域VP16的表达载体并转化酵母菌株实验证明，MYB189为转录抑制子。为了确定MYB189的抑制结构域，分别构建MYB189不同长度的氨基酸序列片段融合激活结构域VP16的载体，通过酵母转录激活实验和烟草瞬时侵染实验，确定MYB189蛋白的抑制结构域位于C端，序列为：GDDYGNHGMIKKE。为了研究MYB189基因的组织表达特异性，检测其在不同组织中的表达情况，并结合启动子组织表达特异性分析，发现MYB189在杨树茎和根的维管组织中表达水平较高。
(3)在拟南芥中证实MYB189负调控次生壁的生物合成
为了初步研究MYB189基因的功能，首先在拟南芥中过表达MYB189，经过筛选得到转基因纯合体植株。表型观察发现MYB189过表达植株出现倒伏现象。对植株花序轴进行切片分析和组织化学染色，发现过表达植株花序轴中出现维管组织发育迟缓和木质部区域变窄的现象。并且定量结果显示，部分次生壁生物合成关键酶基因在MYB189过表达植株中被下调表达。说明在拟南芥中过表达MYB189负调控次生壁的生物合成。
(4)MYB189负调控杨树茎中次生壁的生物合成
为了研究MYB189转录因子在杨树次生壁生物合成中所发挥的功能，将MYB189过表达载体转化毛白杨(Populus tomentosa)，发现转基因植株生长受到抑制，并出现倒伏现象，同时植株的茎变细，生物量降低。茎组织切片显示，过表达MYB189导致植株的木质部区域变窄，同时纤维细胞细胞壁厚度显著变薄。细胞壁组分含量测定结果显示，转基因植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量均显著降低，说明在杨树中过表达MYB189能够抑制次生壁的沉积。为了明确MYB189对次生壁合成调控的分子机制，对野生型和MYB189过表达植株进行高通量测序分析及定量检测。结果显示，大部分参与次生壁生物合成的关键酶基因及部分相关NAC和MYB转录因子在MYB189过表达植株中被下调表达。此外，还构建了MYB189-RNAi干扰表达载体，转化毛白杨并进行分析。发现转基因植株与野生型相比未呈现显著差异，暗示在杨树基因组中可能存在与MYB189功能冗余的基因。
(5)MYB189可通过SMRE元件直接调控NAC以及下游关键酶基因。
为了深入阐明MYB189调控次生壁生物合成的分子机制，对次生壁生物合成中关键酶基因启动子序列进行分析，发现C4H2、COMT2、GT43B和CesA2B这四个基因的启动子上均含有SMRE结合位点。通过ChIP定量PCR和烟草瞬时侵染实验发现，MYB189可通过结合SMRE位点，直接抑制次生壁生物合成关键酶C4H2、COMT2、GT43B和CesA2B基因的表达。在对MYB189过表达植株高通量测序分析和定量检测中还发现，次生壁调控网络上游多个WNDs开关基因被下调表达。同样对这些基因启动子序列进行分析，发现WND2A和WND2B两个基因的启动子上也均含有SMRE结合位点。烟草瞬时侵染实验及ChIP-qPCR同样证实MYB189可直接结合WND2A和WND2B基因启动子的SMRE位点来抑制其表达。
上述结果表明，MYB189可通过直接抑制WND2A/2B、C4H2、COMT2、GT43B和CesA2B的表达，进而抑制毛白杨次生壁的形成和次生木质部的发育。
(6)MYB031主要在茎的木质部和根中表达
前期研究发现MYB031在木质部中表达最高，暗示MYB031可能参与调控木质部的发育过程。且MYB031为转录激活子，说明MYB031与MYB189可能通过不同的调控方式参与调控次生壁的生物合成。因此对MYB031的功能进行深入研究。组织表达谱分析发现，MYB031主要在木质部中表达。克隆MYB031基因的启动子，在杨树中进行组织表达特异性分析，GUS组织染色发现其主要在茎的木质部和叶片中表达。
(7)过表达MYB031抑制毛白杨中次生壁的生物合成
为了明确MYB031在杨树中所发挥的功能。首先在毛白杨中过表达MYB031，发现转基因植株的生长受到明显的抑制，同时叶片出现不平展以及叶边缘向上卷曲的现象。组织切片及化学染色发现，转基因杨树叶片中叶脉发育异常，叶脉中维管发育受到抑制，叶脉与叶片之间的夹角发生变化，叶片出现不平整的现象。同时过表达MYB031导致毛白杨茎中木质部区域细胞层数减少，纤维和导管细胞壁均变薄。细胞壁组分测定结果显示，MYB031过表达植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量均显著下降。同时对转基因植株进行高通量测序和qRT-PCR分析，结果显示，在MYB031过表达植株中部分木质素、纤维素和木聚糖生物合成关键酶基因的表达量均出现不同程度的下调。同时发现，次生壁调控网络上游部分一级开关调控基因WNDs和二级开关调控基因MYBs被显著下调表达。
(8)降低MYB031的表达促进毛白杨次生壁的生物合成
为了进一步验证MYB031的功能，构建了其RNAi干扰表达载体，并转化毛白杨，发现在MYB031-RNAi转基因植株茎组织的髓部区域出现木质素的异位沉积，并且转基因植株中木质素、纤维素和半纤维素的含量均有所上升。qRT-PCR结果显示，部分次生壁合成关键酶基因、一级主开关及二级主开关调控基因均上调表达。
(9)MYB031通过与JAZ1相互作用负调控次生壁的生物合成
为了研究MYB031的分子调控机制，通过酵母双杂交文库进行筛选，发现MYB031能够与茉莉酸(Jasmonates，JAs)信号转导途径中的JAZ1(JASMONATE-ZIM-DOMAIN PROTEIN 1)蛋白相互作用，并通过酵母双杂交和BiFC实验进一步证实了两个蛋白在体内和体外均能够相互作用。烟草瞬时侵染实验结果表明，MYB031通过与JAZ1相互作用共同抑制次生壁生物合成主开关基因WNDs启动子的表达。同时，对野生型和MYB031过表达植株进行MeJA处理，茎组织切片及染色结果显示，MYB031过表达植株在MeJA处理后，木质部纤维和导管细胞的细胞壁沉积被抑制的现象明显被消除。综上结果表明，转录激活子MYB031对次生壁沉积的抑制作用依赖于与JAZ1的相互作用。
MYB189和MYB031虽然同在一个亚族，却通过不同的方式负调控次生壁的生物合成。MYB189为抑制子通过直接调控WNDs和次生壁生物合成关键酶基因的表达来抑制次生壁的沉积，而MYB031为激活子通过与JAZ1相互作用来抑制WNDs基因的表达，从而抑制次生壁的沉积。本论文的研究结果为MYB转录因子调控次生壁的生物合成提供了新的作用机制，并进一步丰富了杨树次生壁生物合成调控网络。