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第一部分巨噬细胞膜包裹载药PLGA纳米粒的制备及表征研究目的:提取巨噬细胞膜、制备载HCPT-PLGA纳米粒及巨噬细胞膜包裹载HCPT-PLGA纳米粒(HCPT-MCNP),并评价其表征。方法:采用低渗裂解结合脂质体挤出仪的机械破坏法破坏细胞结构,差速离心分离保留有完整膜蛋白序列的细胞膜,并采用荧光染色验证提取的是不含细胞核的纯化细胞膜。乳化法制备载HCPT-PLGA纳米粒,提纯的巨噬细胞膜与制备的HCPT-PLGA通过脂质体挤出仪共挤得到HCPT-MCNP。体外评价其形态、粒径、分布、电位、稳定性及药物包封率、载药率、药物释放率等。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测MCNP纳米粒上巨噬细胞膜蛋白的保留情况。结果:(1)采用低渗缓冲液结合脂质体挤出仪机械破坏法破坏细胞结构后得到细胞裂解产物,同时包含了细胞膜,细胞核及其他一些细胞亚结构。差速离心法离心一次后提取物中同时可见蓝色的细胞核荧光和橙红色细胞膜荧光,重复离心一次后几乎只有红染的细胞膜而没有蓝染的细胞核。(2)乳化法制备载HCPT-PLGA能得到形态规则,粒径较为均一的负载有HCPT药物的PLGA纳米粒。其平均粒径为201.5±2.7 nm,其表面电位为-25.78±3.78m V,透射电镜(TEM)观察见形态呈圆形,紫外分光光度法检测包封率为69.34±3.31%、载药率为0.81±0.02%(n=3)。(3)MCNP平均粒径为208.2±1.4 nm,其表面电位为-12.33±1.08 m V。TEM观察鉴定形态可见呈圆形,外表面有一层包裹的膜形成核-壳结构,在电镜下测量厚度约7 nm,与MCNP和PLGA粒径差相符。紫外分光光度法检测包封率57.80±8.75%、载药率为0.59±0.10%(n=3)。(4)PLGA与MCNP在PBS中均具有较为良好的稳定性,粒径维持在200 nm左右。(5)荧光分光光度法检测药物释放率,HCPT-PLGA与HCPT-MCNP具有类似的释放曲线,在24 h时其内的药物释放率分别达到58.91%和57.19%,之后几乎不再往外进一步释放药物而处于一个药物浓度平台期。(6)SDS-PAGE凝胶电泳结果显示MCNP与提取出的巨噬细胞膜蛋白具有相类似的蛋白序列,也即MCNP保留了巨噬细胞膜蛋白。结论:本研究成功制备载HCPT的PLGA纳米粒并成功包裹巨噬细胞膜制得MCNP,获得粒径稳定的纳米粒,且在PBS中能缓慢释放其负载的药物,从而具有治疗肿瘤的潜能。第二部分细胞靶向与免疫逃逸验证研究目的:验证制备的PLGA与MCNP纳米粒对CT 26肿瘤细胞的靶向作用及避免巨噬细胞RAW 264.7吞噬的作用。方法:制备出的荧光标记的PLGA与MCNP分别与CT 26细胞及RAW 264.7细胞共孵育,荧光显微镜观察CT 26细胞及RAW 264.7细胞分别对其的吞噬率,流式细胞学进行定量。结果:荧光显微镜下,MCNP组与CT 26细胞荧光重合区域比PLGA组大;MCNP组与RAW 264.7细胞荧光重合区域比PLGA组小。CT 26细胞对PLGA和MCNP的相对摄取率分别为74.83±1.14%、95.80±0.79%,具有显著的统计学差异(p=0.0019)。RAW264.7细胞对PLGA和MCNP的相对摄取率分别为23.5±0.45%、12.4±1.88%,具有统计学差异(p=0.0156)。结论:巨噬细胞膜包裹后能促进CT 26细胞对纳米粒的摄取从而实现纳米粒靶向癌细胞的功能、减少RAW 264.7细胞对纳米粒的摄取达到免疫逃逸的作用。