论文部分内容阅读
目的:运用酵母双杂交技术,从人心脏c DNA文库中筛选与CVB3非结构蛋白3A相互作用的人细胞蛋白;选取阳性蛋白之一的TMED4进行研究,探讨CVB3 3A与TMED4的相互作用及其生物学意义,为进一步研究CVB3的致病机制及治疗CVB3引起的相关疾病提供新的方向和依据。方法:1.以病毒RNA为模板,逆转录合成c DNA,再经PCR扩增出3A基因,并将其重组至真核表达质粒p GBKT7中,构建诱饵质粒p GBKT7-3A;2.采用乙酸锂法将诱饵质粒p GBKT7-3A转化至酵母菌AH109中;3.Western Blot检测融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A在酵母菌AH109[p GBKT7-3A]中的表达;4.SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp营养缺陷培养基及X-α-Gal实验检测3A对报告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的转录自激活作用,小规模配合实验检测酵母菌的配合功能;5.大规模配合筛选与3A蛋白相互作用的人细胞蛋白;6.采用表型鉴定、PCR扩增和Alu I酶切等实验方法对筛选所得阳性候选克隆进行归类、测序及同源性比对分析;7.SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu营养缺陷培养基的鉴定方法及X-α-Gal实验检测筛选所得阳性质粒p GADT7-ADx对报告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的转录自激活作用,利用回返配合实验初步验证3A蛋白与各阳性蛋白的相互作用;8.质粒p Bud CE4.1-3A转染He La细胞36 h后,采用免疫荧光双标技术,用Alexa Flour 488山羊抗兔二抗(绿色荧光)与兔抗TMED4的特异性结合来标记TMED4在细胞内的定位,用Rhodamine山羊抗鼠二抗(红色荧光)与鼠抗His-Tag的特异性结合来标记3A在细胞中的定位,利用高内涵细胞成像分析系统观察3A蛋白与TMED4在细胞内的共定位情况,同时设立正常细胞作为阴性对照;9.质粒p Bud CE4.1-3A转染He La细胞48 h后,收集细胞蛋白裂解液,分别采用anti-TMED4或anti-His-Tag进行细胞内免疫共沉淀,进一步验证3A蛋白与阳性蛋白TMED4之间的相互作用;10.收集质粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1转染后24 h、36 h、48 h各时间点细胞,加入CCK-8溶液后酶标仪检测波长490 nm处各样品OD值,采用SPSS 13.0软件对结果进行分析;11.收集质粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1转染后24 h、36 h、48 h各时间点细胞,使用Annexin V试剂盒对早期凋亡细胞进行染色后,高内涵细胞成像分析系统对早期凋亡细胞进行计数分析;12.质粒p Bud CE4.1-3A对细胞周期的影响:以G1/S期为切入点,收集质粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1转染后24 h、36 h、48 h、54 h各时间点的细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化;13.用质粒p Bud CE4.1-3A转染He La细胞18 h、24 h、36 h、40 h、48 h、54 h、60 h,采用MOI=5的CVB3感染He La细胞3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h,收集各时间点细胞蛋白裂解液,同时设立正常细胞和空质粒转染组细胞为对照,Western Blot检测细胞内TMED4的表达情况。结果:1.双酶切鉴定及测序结果提示3A已成功重组至p GBKT7载体的多克隆位点,且阅读框与病毒3A基因一致;2.表型鉴定和PCR法验证重组诱饵质粒p GBKT7-3A已成功转入酵母菌AH109中;3.3A能在酵母菌AH109[p GBKT7-3A]中表达并且对酵母菌无毒性作用;4.SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp营养缺陷培养基和酶底物X-α-Gal颜色的变化情况显示3A对报告基因无转录自激活作用,小规模配合实验表明3A蛋白在AH109中的表达不影响酵母菌的配合功能;5.以CVB3 3A为诱饵,经大规模配合实验,从人心脏c DNA文库中筛选得到52个阳性候选克隆;6.五十二个阳性候选克隆经Alu I酶切分析后可归为6类,通过测序和同源性比对,共获得6种不同类别的阳性蛋白:兰尼碱受体2(Ryanodine Receptor2,Ry R2),信号肽酶2(Signal peptidase complex subunit 2,SPCS2),跨膜蛋白emp24(Transmembrane emp24 protein transport domain containing 4,TMED4),细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I,COX1),细胞色素c氧化酶亚基III(Cytochrome c oxidase subunit III,COX3)和肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH7)/琥珀酸脱氢酶亚基D(Succinate dehydrogenase complex subunit D,SDHD);7.SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu营养缺陷培养基和酶底物X-α-Gal颜色的变化情况显示6种阳性蛋白对报告基因无转录自激活作用,回返配合实验初步验证6种阳性蛋白与3A蛋白存在相互作用;8.高内涵细胞成像分析系统显示宿主蛋白TMED4主要在胞浆中表达,而病毒蛋白3A主要表达在胞浆核周区域,提示3A与TMED4在细胞胞浆内存在共定位现象;9.在质粒p Bud CE4.1-3A转染后的细胞中,3A蛋白能够被anti-TMED4抗体共沉淀,而TMED4也能够被anti-His-tag抗体共沉淀。细胞内免疫共沉淀结果提示:在质粒p Bud CE4.1-3A转染后的细胞内,3A与TMED4能够发生相互作用;10.CCK-8法结果提示:质粒p Bud CE4.1-3A转染细胞后36 h时间点细胞活性与空质粒转染组相比明显下降,且差异具有统计学意义,而转染24 h和48 h时间点的细胞活性与空质粒转染组相比无明显差异;11.高内涵细胞成像分析系统观察早期凋亡细胞:质粒转染后36 h,3A转染组凋亡细胞数较空质粒转染组有明显增高,且差异具有统计学意义,而转染24 h和48 h时间点两组细胞并无明显差异;12.流式细胞仪检测结果显示:转染3A的细胞组G1期细胞比例一直高于转染空质粒的对照组,54 h细胞组G1期细胞比例差异具有统计学意义(P<0.05),而S期、G2期的细胞比例没有明显变化。13.收集质粒转染和活病毒感染各时间点细胞蛋白裂解液,Western Blot检测结果:3A转染细胞后,细胞内的TMED4表达量逐渐下降,于转染36 h时间点达到最低,随后开始回升,至60 h后维持稳定;空质粒转染对照组细胞内TMED4表达量未发现明显改变;CVB3活病毒感染细胞后细胞内TMED4的表达逐渐下降,于感染9 h时间点达到最低,随后开始回升,正常细胞对照组TMED4表达量无明显改变。质粒转染实验和活病毒感染实验两项结果存在一致性。结论:1.以CVB3 3A为诱饵,应用酵母双杂交技术,成功从人心脏c DNA文库中筛选获得6种与3A相互作用的人心脏蛋白:Ry R2、SPCS2、TMED4、COX1、COX3和MYH7/SDHD;2.3A与阳性蛋白TMED4在细胞内可能存在相互作用;3.3A在细胞中的表达影响细胞的活性,并通过下调TMED4的表达量来参与细胞凋亡;