[研究背景]胃癌是世界范围内的一种重要癌症,全球发病率排名第五,死亡率排名第四。近年来由于胃镜等早期筛查技术的普及,早期胃癌的发现率有所提高,但死亡率仍居高不下。因此,探究胃癌发生与发展的机制,寻找胃癌的早期标志物及预防治疗药物,对胃癌的治疗具有重大意义。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）与胃炎和胃癌的发生发展有着密切的关联。幽门螺杆菌可以在胃部定植进而导致一系列的病理变化,因此探究幽门螺杆菌在胃癌发生发展中的作用,对幽门螺杆菌相关胃癌的诊断与治疗具有重要意义。硫化氢（H2S）是继CO、NO之后发现的第三种内源性气体介质,通过自分泌和旁分泌方式调节多种细胞功能。在哺乳动物细胞中产生H2S的酶包括胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthetase,CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-y-lyase,CSE）和3-疏基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate,3-MST）。内源性H2S在疾病中的重要作用已被证明,但其与癌症的关系是H2S生物学的一个新兴领域,具有巨大的研究潜力。近年来CSE、CBS、3-MST与肿瘤关系的相关研究越来越多,但多数研究主要聚焦于结直肠癌,且其中相关CSE的研究较少,尤其是CSE在胃癌中的作用尚未完全阐明。大蒜是日常生活中常见的一种食物,大蒜的防癌与抗氧化作用已被证实。大蒜在体内消化后会产生H2S,这可能与大蒜的抗肿瘤机制有关。二烯丙基三硫醚（Diallyl trisulfide,DATS）是一种大蒜有机硫化物,研究发现DATS具有诱导肿瘤细胞的凋亡,影响细胞周期以及引起线粒体膜电位的变化等作用。综上所述,以往研究已证明DATS在抑制肿瘤中起一定的作用,但具体机制不明。产生H2S的酶与胃癌的发生发展是否有相关性?DATS是否能够影响内源性H2S和ROS（Reactive oxygen species）的产生?是否能够抑制幽门螺杆菌在胃癌发生发展中的作用?DATS诱导肿瘤细胞凋亡的具体靶点是什么?以上问题均未明确。因此,阐明DATS与幽门螺杆菌以及H2S和ROS的产生之间的关系,对于判断DATS能否作为预防与治疗幽门螺杆菌相关胃癌的潜在药物具有重要的临床意义。[研究目的]本研究旨在探究DATS对胃黏膜与胃癌细胞中CSE表达及其对内源性H2S产生和ROS水平的影响,同时探究DATS对幽门螺杆菌引起的CSE表达变化的影响,进一步阐明CSE在胃癌发生发展中的作用,为临床预防和治疗胃癌提供新的分子靶点和潜在药物。[研究方法]1.通过Meta分析研究大蒜摄入与降低胃癌和结直肠癌风险的关系。2.使用Q-PCR和Western blot法检测正常胃黏膜上皮细胞GES1以及胃癌细胞MKN45、HGC27、MGC803的CSE表达情况,以及与幽门螺杆菌HP26695共培养后CSE的表达变化。3.用组织芯片法检测CSE在正常胃黏膜组织和胃癌、癌旁组织中的表达差异。4.用DATS处理细胞后,Q-PCR和Western blot法检测CSE的表达变化。5.SiRNA干扰CSE表达后,用CCK-8法、EDU法检测CSE对胃癌细胞增殖能力的影响,用Transwell法检测CSE对胃癌细胞迁移能力的影响。6.用荧光探针检测DATS、NaHS、H2O2对正常胃黏膜上皮细胞GES1和胃癌细胞MKN45、HGC27、MGC803的H2S和ROS产生的影响。7.代谢组学分析DATS和HP26695处理后胃癌细胞MKN45的代谢差异。[研究内容与结果]1.Meta分析结果Meta分析的结果表明食用大蒜可以明显降低患胃癌和结直肠癌风险,同时地区亚组分析表明亚洲地区的风险降低明显低于其它地区,纳入的大部分研究均表明摄入大蒜可以降低人群患消化道肿瘤风险。2.与正常胃黏膜细胞相比,CSE在胃癌细胞中的表达上调Q-PCR和Western blot结果表明CSE在正常胃黏膜上皮细胞GES1中的表达量低于胃癌细胞 MKN45、HGC27、MGC803。3.组织芯片分析结果组织芯片检测了 28对胃癌患者肿瘤和癌旁组织,以及4例正常胃黏膜组织中CSE的表达情况后,结果表明CSE在胃癌组织中的表达量高于癌旁以及正常胃黏膜组织。4.HP26695共培养后CSE的表达增高分别用MOI=50、100、150的幽门螺杆菌菌株HP26695与各个细胞系共培养24h,Q-PCR和Western blot结果表明无论是在正常胃黏膜上皮细胞还是胃癌细胞中,HP26695均能引起CSE表达的上调,再以MOI=150的幽门螺杆菌菌株HP26695与各个细胞分别共培养0h、3h、6h、9h、12h,Q-PCR和Western blot结果表明共培养9h和12h后,幽门螺杆菌菌株HP26695可以引起四种细胞系中CSE表达的上调。5.CSE促进胃癌细胞的增殖与迁移SiRNA 转染胃癌细胞 MKN45、HGC27、MGC803 48h 后,进行 CCK-8、EDU 和Transwell实验,结果表明干扰CSE的表达后,胃癌细胞MKN45、HGC27和MGC803的增殖能力和迁移能力明显降低。6.不同浓度的DATS和NaHS导致CSE的表达降低在正常胃黏膜上皮细胞GES1和胃癌细胞MKN45、HGC27和MGC803中分别加入 10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL 的 DATS,Western blot 结果表明 DATS 可以使四种细胞系中CSE的表达下降。同理将400μM、800μM的NaHS分别加入到各个细胞系中处理24h,Western blot结果表明NaHS可以使四种细胞系中的CSE表达下降,其中正常胃黏膜上皮细胞GES1下降最明显。7.DATS可以抑制和预防幽门螺杆菌引起的CSE表达增高首先用MOI=150的幽门螺杆菌菌株HP26695与正常胃黏膜上皮细胞GES1和胃癌细胞MKN45、HGC27和MGC803共培养24h后,将40μg/mL的DATS加入各个细胞系中处理24h,Western blot结果表明在四种细胞系中,DATS可以一定程度上抑制HP26695引起的CSE表达增高,其中在正常胃黏膜上皮细胞GES1中的效果最明显,其次我们先用40μg/mL的DATS处理细胞24h,再用MOI=150的幽门螺杆菌菌株HP26695共培养24h,Western blot结果表明在四种细胞系中,DATS可以一定程度上预防HP26695导致的CSE表达升高。8.DATS可以促进胃癌细胞中caspase-3表达增高用40μg/mL的DATS处理胃癌细胞MKN45和HGC27 24h后,Western blot结果表明DATS可以促进细胞中caspase-3的表达,从而激活胃癌细胞的凋亡。9.DATS、NaHS、H2O2引起细胞中H2S和硫烷硫（Sulfane Sulfur）的产量增加用DATS、NaHS、H2O2处理细胞后,使用荧光探针检测H2S和Sulfane Sulfur的产量变化。结果表明DATS、NaHS、H2O2在四种细胞系中均能引起H2S和Sulfane Sulfur的产量增加。10.H2O2引起细胞中ROS的水平增加,而DATS、NaHS导致细胞中ROS水平下降。用DATS、NaHS、H2O2处理细胞后,使用荧光探针检测ROS水平变化。结果表明H2O2在四种细胞系中均能引起ROS水平升高,而DATS和NaHS则导致ROS水平下降。[研究结论]1.本研究首次发现,DATS可以抑制幽门螺杆菌引起的正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞中CSE表达的增高。2.干扰CSE的体外实验表达证明,CSE可以促进胃癌细胞的增殖和迁移。3.DATS通过促进caspase-3的表达激活胃癌细胞的凋亡。4.DATS通过促进细胞内H2S和硫烷硫sulfane sulfur的产生来发挥抗氧化作用。5.DATS降低细胞内ROS的水平来对抗氧化应激。