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研究背景:精神分裂症是一种严重的慢性精神疾病,对患者个人及家庭、社会产生巨大影响。奥氮平是治疗精神分裂症的临床一线用药。但长期用药容易引起肥胖、血脂异常和糖尿病等代谢不良反应,增加精神分裂症患者死亡风险。奥氮平介导产热损伤致使能量失衡是该药物引起机体过度肥胖的重要原因之一。棕色脂肪组织是机体主要的产热器官,表观遗传在调控棕色脂肪组织产热作用中发挥重要功能。课题组前期研究发现,奥氮平作用后小鼠棕色脂肪组织中组蛋白甲基化修饰显著变化,组蛋白去甲基化酶Jumonji结构域的蛋白2B（jumonji domain-containing protein 2B,JMJD2B）表达也因药物作用显著下调,但JMJD2B在奥氮平介导棕色脂肪产热损伤中的具体机制尚不清楚。因此,阐明JMJD2B在奥氮平介导棕色脂肪组织能量代谢异常中的作用对理解表观遗传调控在药源性代谢疾病发生发展过程中的分子机制意义重大。研究目的:探究奥氮平介导组蛋白甲基化修饰异常及其分子机制,为临床干预奥氮平引起的体重增加等代谢副反应提供新的策略。方法与结果:1.奥氮平对SD大鼠体重、产热及糖脂代谢的影响选取雌性SD大鼠20只,8周龄,体质量180-220 g,随机分组:空白对照组,奥氮平给药组（1 mg/kg,1天3次）,给药28天,监测大鼠的体重、饮水、摄食、体温及血糖血脂。结果显示,与对照组相比,奥氮平引起大鼠体重显著增加（p＜0.05）,肩胛温度显著降低（p＜0.01）,血清中甘油三酯（TG）水平显著增加（p＜0.05）,总胆固醇（TC）水平极显著增加（p＜0.01）。免疫组化、Western Blot和q PCR分析发现,奥氮平显著降低Fgf21、Pparγ、Prdm16、Rxrα、Ucp1的m RNA表达（p＜0.01）及其蛋白表达（p＜0.01）。2.奥氮平上调棕色脂肪组织中H3K9me3水平为了探究奥氮平对棕色脂肪组织中组蛋白甲基化修饰的影响,取大鼠棕色脂肪组织进行ChIP-seq和转录组测序。结果显示,与棕色脂肪能量代谢相关的多条通路,包括“脂肪组织发育”、“白色脂肪细胞分化”、“脂肪细胞分化正调控”发生显著变化。进一步分析发现,与能量代谢相关的基因,如Prdm16和Rxrα等基因的启动子区域H3K9me3的富集增加。此外,对转录组测序结果进行分析并进一步验证,发现奥氮平作用后Jmjd2b转录水平显著下调,|log2（倍数变化）|≥1.4,P值≤0.05。3.奥氮平作用JMJD2B降低棕色脂肪组织产热相关基因表达为了进一步探究JMJD2B在奥氮平介导的棕色脂肪产热失衡中的作用,我们首先分析了免疫组化和Western Blot检测肝脏、肌肉、白色脂肪和棕色脂肪等组织中JMJD2B的表达。结果发现,与对照组相比,奥氮平作用后棕色脂肪组织中JMJD2B的蛋白表达呈现显著性（p＜0.01）。随后,分别构建JMJD2B的敲降和过表达的C3H10T1/2稳转细胞株,经诱导分化为棕色脂肪细胞后,对其进行5μM奥氮平处理24 h。与对照组相比,敲降JMJD2B后H3K9me3全局表观遗传标记显著增加（p＜0.05）,而RXRα（p＜0.05）和PRDM16（p＜0.05）的蛋白表达显著下降;与敲降组相比,奥氮平作用后这些表观遗传标记增加更明显。此外,JMJD2B过表达导致H3K9me2（p＜0.05）和H3K9me3（p＜0.01）全局表观遗传标记显著减少,且RXRα（p＜0.01）和PPARγ（p＜0.05）的蛋白表达均显著增加;与奥氮平组相比,过表达JMJD2B后H3K9me3的蛋白表达显著下降（p＜0.01）,且RXRα的蛋白表达显著增加（p＜0.01）。4.JMJD2B-Ser478磷酸化异常是奥氮平引起棕色脂肪产热受损的关键位点为了探究奥氮平是否通过影响JMJD2B磷酸化水平从而降低其酶活性,首先通过Western Blot检测奥氮平作用后棕色脂肪组织中核内外JMJD2B的表达及蛋白激酶PKA的表达。结果发现,与对照组相比,奥氮平显著降低棕色脂肪组织中细胞核内JMJD2B的蛋白表达（p＜0.01）及PKA的蛋白表达（p＜0.05）。为了证实奥氮平对JMJD2B磷酸化的影响并进一步探究其可能的作用位点,首先通过Net Phos 3.1 Server网站预测并筛选了JMJD2B发挥酶活作用的两个磷酸化位点Ser452和Ser478。然后将这两个位点突变为丙氨酸（Ala）,分别为S478A和S452A。Western Blot分析发现,与野生型相比,奥氮平联合H89作用后细胞核中JMJD2B的蛋白表达显著降低（p＜0.01）;与S478A突变组相比,奥氮平联合H89作用后S478A突变的细胞核中JMJD2B的蛋白表达显著降低（p＜0.05）。对S478A突变后细胞中产热相关因子的蛋白表达分析发现,与野生型相比,奥氮平联合H89作用后突变组RXRα的蛋白水平显著下调（p＜0.05）。结论:奥氮平通过抑制PKA活性,影响JMJD2B的磷酸化从而降低其活性,使产热关键蛋白UCP1的多个转录因子Rxra、Fgf21和Prdm16启动子区域募集更多的H3K9me3,从而抑制其转录,导致产热损伤,引起能量代谢紊乱。本研究可为临床上奥氮平等抗精神病药物引起的代谢不良反应的治疗提供基础理论。