肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。全世界范围内,肺癌的致死率约占所有肿瘤的27%。临床上,约有85%的肺癌属于非小细胞肺癌。与小细胞肺癌相比,非小细胞肺癌对放射性疗法和化学疗法具有更高程度的耐受性,因此药物耐受是临床上亟待攻克的问题之一。GCN2(general control non-derepressible2)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能够通过结合未携带氨基酸的转运RNA(unchargedtRNA)感受环境中的氨基酸缺失,从而发生自身磷酸化。在前期研究中,我们发现GCN2的磷酸化在非小细胞肺癌的顺铂耐受中发挥重要作用,抑制非小细胞肺癌细胞中GCN2的磷酸化能够增强细胞对顺铂的敏感性。哇巴因是一种内源性强心苷物质,在非小细胞肺癌病人中表达升高,它能通过诱导GCN2磷酸化促进非小细胞肺癌细胞对顺铂产生药物耐受,但作用机制不详。Na+/K+-ATP ase是哇巴因的特异性受体,通过结合细胞膜表面的Na+/K+-ATPase,哇巴因能激活SRC/EGFR、升高细胞内钙离子水平。本研究分别用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM、SRC抑制剂PP2预处理细胞,发现BAPTA-AM能够显著阻断哇巴因磷酸化GCN2的过程。表明:钙离子参与了哇巴因诱导GCN2磷酸化的过程。进一步研究发现,细胞内绝大部分升高的钙离子来源于L-型钙通道和内质网/肌浆网的钙库。钙离子是细胞内广泛存在的重要信号传递信使,参与很多信号通路的激活与调控。文献表明,细胞内Ca2+水平的上调能够激活MAPK信号通路,MAPK信号通路参与调控肿瘤细胞的生长、增殖、分化等过程。在本研究中,分别用钙离子螯合剂BAPTA-AM、L-型钙通道抑制剂nifedipine和MEK1抑制剂PD0325901处理细胞,发现三种抑制剂均能有效抑制哇巴因对ERK1/2的激活,同时均能抑制哇巴因对GCN2的激活。结果表明:Ca2+-MAPK参与哇巴因诱导GCN2磷酸化的过程。GCN2的磷酸化与细胞中氨基酸水平密切相关,本研究发现哇巴因能抑制非小细胞肺癌细胞中总氨基酸水平,进一步通过LC-MS测定方法,发现哇巴因能够在低浓度时刺激细胞内多种氨基酸含量增高,而在高浓度情况下显著下调细胞内的多种氨基酸含量,造成细胞内环境中的氨基酸缺失与GCN2磷酸化水平的增高。为了进一步考察MAPK信号通路与GCN2磷酸化之间的关系,本实验构建了 MEK1持续激活突变体(MEK1-CA),过表达MEK1-CA能够有效激活MAPK信号通路,并且过表达MEK1-CA可以上调氨基酸代谢酶BCAT1、BCAT2,下调氨基酸转运体SNAT2、CAT1的表达,本研究证实MAPK通路影响细胞内部分氨基酸的摄取和分解代谢过程。综上,本文首次发现哇巴因既可以通过激活Ca2+-MAPK信号通路磷酸化GCN2,又能够通过诱发细胞中的氨基酸缺失激活GCN2,而且MAPK通路激活之后,能够部分影响细胞内氨基酸的摄取和代谢。GCN2磷酸化后诱导肺癌细胞对铂类药物产生耐受。本文初步探索了哇巴因磷酸化GCN2的分子生物学机制,为克服肺癌顺铂耐药提供了理论依据。