目的：　　半胱氨酸脱硫酶是一类依赖磷酸吡哆醛的同质二聚体酶，能够催化底物L-半胱氨酸脱硫生成L-丙氨酸及酶过硫化物中间物。大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶IscS因含有辅因子PLP通常呈现黄色。本实验在课题组前期研究发现缺铁环境和大肠杆菌双敲除菌E.coli iscA-sufA-MC4100中过表达的IscS蛋白颜色为红色的基础上，发现嵌合型半胱氨酸脱硫酶EH-IscS在15℃冷休克培养条件下过表达时也为红色，且进一步发现富营养化培养基联合冷休克培养条件可以产生在528 nm处具有明显特征性吸收峰的红色IscS。本实验通过分析冷休克条件下大肠杆菌铁硫簇组装水平变化、培养基成分改变对红色蛋白累积的影响以及黄色与红色蛋白的活性差异，以探究冷休克条件下产生的红色半胱氨酸脱硫酶形成的原因及生理意义。　　方法：　　1．构建一种新的大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒pCold-SUMOa　　以pE-SUMOproKan质粒为模板，采用SUMO-F/R引物扩增获得SUMO基因编码框片段。以pCold TF质粒为模板，采用pCold-F/R引物扩增pCold质粒骨架片段。采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒pCold-SUMOa。　　2．表达半胱氨酸脱硫酶重组质粒的构建　　(1)、构建表达大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶的重组质粒　　以大肠杆菌E.coli MC4100基因组为模板，扩增IscS编码框基因。Kpn I单酶切pCold I质粒，然后采用无缝克隆技术构建获得重组质粒IscS-pCold I。　　(2)、构建表达人源半胱氨酸脱硫酶的重组质粒　　以NFS1(55-457)-pET28b质粒为模板扩增获得含有编码人源半胱氨酸脱硫酶55-457位氨基酸的基因序列，pCold I、pCold-GST、pCold-SUMOa和pCold TF质粒单酶切后并胶回收酶切后载体片段。然后用无缝克隆技术将NFS1基因连接至单酶切后载体片段中，获得NFS1-pCold I, NFS1-pCold-SUMOa, NFS1-pCold-GST和NFS1-pCold TF重组质粒。　　(3)、构建表达嵌合型半胱氨酸脱硫酶的重组质粒　　以EH-IscS-pET28质粒为模板扩增获得EH-IscS基因， pCold I, pCold-GST， pCold-SUMOa和pCold TF质粒单酶切后胶回收，采用无缝克隆技术分别将EH-IscS基因连接至上述四个单酶切后载体片段中，获得 EH-IscS-pCold I, EH-IscS-pCold-GST, EH-IscS-pCold TF, EH-IscS-pCold-SUMOa重组表达质粒。　　(4)、构建EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa和EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa突变质粒　　根据突变位点处的序列分别设计5′端包含互补同源臂序列的正向和反向突变引物，利用基于体外同源重组的无缝克隆技术的基因定点突变方法，构建EH-IscS蛋白的第206位赖氨酸突变为丙氨酸的EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa重组质粒和第328位半胱氨酸突变为丝氨酸的EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa重组质粒，含有突变位点的重组质粒送上海华大基因测序。　　3.重组半胱氨酸脱硫酶的纯化与分析(1)重组半胱氨酸脱硫酶的分离与纯化　　15℃培养条件下诱导表达 IscS, EH-IscS, GST-EH-IscS, TF-EH-IscS, TF-NFS1(55-457), SUMO-NFS1(55-457), SUMO-EH-IscS蛋白，经Ni柱亲和层析纯化和 G-25脱盐以获取目的蛋白。纯化后的蛋白进行全波长扫描分析和SDS-PAGE电泳分析。　　(2)重组半胱氨酸脱硫酶活性的测定　　将纯化好的蛋白样品与L-半胱氨酸、DTT在37℃条件下进行孵育，IscS可催化底物L-半胱氨酸脱硫，在DTT存在的条件下形成不稳定的硫化氢，硫化氢与FeCl3相互作用，在DPD作为显色剂的情况下生成蓝色络合物在669nm处有特异的吸收峰，利用公式及硫的消光系数可得出蛋白中硫的含量，硫含量的多少可以直接反映蛋白活性的高低。　　(3)重组半胱氨酸脱硫酶稳定性的分析　　使DB将纯化好的IscS, EH-IscS, GST-EH-IscS, SUMO-EH-IscS和TF-EH-IscS蛋白浓度分别稀释为1μM，37℃孵育30 min，每隔5min测定蛋白样品在320 nm处的吸光值。如果蛋白样品会发生自我凝集，320nm处吸光值就会随着时间的延长而递增。　　4.15℃冷休克培养条件下大肠杆菌体内IscS红色中间物的累积分析　　IscS, EH-IscS, SUMO-EH-IscS, TF-EH-IscS蛋白在15℃条件下分别诱导24h、48h、72h，收集的菌体破碎后经Ni柱亲和层析纯化和G-25脱盐以获取目的蛋白。纯化后的蛋白进行全波长扫描分析和SDS-PAGE电泳分析。　　5.冷休克培养条件下，铁螯合剂对红色反应物生成的影响分析　　IscS-pCold I/BL21(DE3)菌体在37℃条件下培养至OD值为0.3-0.4时，加入铁螯合剂，15℃静置30min，加入IPTG诱导剂，15℃培养条件下诱导培养24h，蛋白质经Ni柱亲和脱盐纯化。纯化后的蛋白用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描分析，并进行SDS-PAGE电泳分析。　　6.冷休克培养条件对大肠杆菌中[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇组装的影响分析　　Nth-pBAD/E. coli BL21(DE3), SoxR-pBAD/E. coli BL21(DE3)蛋白在37℃和25℃培养条件下诱导表达；Nth-pCold I/E. coli BL21(DE3), SoxR-pCold I/E. coli BL21(DE3)在25℃和15℃培养条件下诱导表达。蛋白质经Ni柱亲和脱盐纯化。纯化后的蛋白用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描分析，并进行SDS-PAGE电泳分析。　　7.15℃冷休克培养条件下铁硫簇组装相关基因的缺失对红色反应物生成的影响分析　　在15℃冷休克培养条件下，通过在存在不同程度铁硫簇组装障碍的大肠杆菌突变菌△iscU、△isc和△iscA△sufA中诱导表达IscS，经Ni柱亲和层析纯化和G-25脱盐以获取目的蛋白。纯化后的蛋白进行全波长扫描和SDS-PAGE电泳分析。　　8.富营养化培养基联合冷休克条件对大肠杆菌红色反应物产生的影响　　在15℃和25℃培养条件下，用不同的培养基诱导表达IscS蛋白，经Ni柱亲和层析纯化和G-25脱盐以获取目的蛋白。纯化后的蛋白进行全波长扫描分析和SDS-PAGE电泳分析。　　9.红色反应物稳定性的分析　　IscS-pBAD/E. coli BL21(DE3)在37℃条件下诱导表达，IscS-pCold I/E. coli BL21(DE3)用含有0.4mM2,2-dipyridyl的LB培养基在15℃条件下诱导表达，然后分别将纯化出来的黄色和红色IscS与10mM L-半胱氨酸在4℃孵育20min，之后进行全波长扫描；在反应体系中加入DTT，然后对蛋白进行全波长扫描分析。　　10.红色反应物与半胱氨酸脱硫酶活性的关系分析　　突变蛋白 IscS-pBAD-K206A/BL21(DE3)， IscS-pBAD-C328S/BL21(DE3), EH-IscS-K206A-pCold-SUMOa/BL21(DE3)， EH-IscS-C328S--pCold-SUMOa/BL21(DE3)在15℃培养条件下诱导表达并纯化，用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描分析。　　11.红色IscS蛋白与黄色IscS蛋白活性的比较　　诱导的红色IscS和黄色IscS与PLP（终浓度为200μM）室温孵育1 h，脱盐去除剩余的PLP，然后取等摩尔浓度的黄色和红色IscS(10μM)检测两者的半胱氨酸脱硫酶活性。　　结果：　　1.表达半胱氨酸脱硫酶重组质粒的构建　　利用无缝克隆和菌落PCR技术，我们成功地构建了冷休克助溶型表达载体pCold-SUMOa，表达大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶的重组质粒IscS-pCold I，表达人源半胱氨酸脱硫酶的重组质 NFS1-pColdI, NFS1-pCold-SUMOa, NFS1-pCold-GST, NFS1-pCold TF，表达嵌合型半胱氨酸脱硫酶的重组质粒EH-IscS-pColdI, EH-IscS-pCold-GST, EH-IscS-pColdTF, EH-IscS-pCold-SUMOa,突变重组质粒 EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa, EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa，并且测序结果也显示以上重组质粒构建成功。　　2.重组半胱氨酸脱硫酶蛋白的纯化与分析　　SDS-PAGE分析表明纯化获得的重组半胱氨酸脱硫酶的蛋白纯度都高于90％。构建的冷休克助溶表达载体pCold-SUMOa可以提高EH-IscS蛋白的可溶性、稳定性和活性。且发现15℃冷休克条件下诱导表达的EH-IscS为淡红色，全波长扫描可以看到在528nm处有微弱的特征性吸收峰。　　3.冷休克培养条件下红色半胱氨酸脱硫酶会在大肠杆菌体内累积　　15℃条件下诱导表达的IscS, EH-IscS, SUMO-EH-IscS, TF-EH-IscS蛋白目的条带单一，且发现随着诱导时间的增加蛋白颜色逐渐由黄变红，且在528nm处的特征性吸收峰也逐渐升高。　　4.冷休克条件可以促进缺铁环境中红色IscS的产生　　15℃冷休克条件下，在普通LB培养基中加入0.1mM的铁螯合剂dipyridyl即可使诱导表达IscS蛋白变红，且随着dipyridyl浓度的增加蛋白红色加深，528nm处的吸收峰也逐渐上升。　　5.冷休克条件下红色反应物的产生与大肠杆菌中铁硫簇组装障碍有关　　诱导表达纯化的Nth-[4Fe-4S]和SoxR-[2Fe-2S]蛋白进行全波长扫描，分析发现25℃培养条件会抑制抑制大肠杆菌[4Fe-4S]簇的组装，而不抑制[2Fe-2S]簇的组装，15℃培养条件下，大肠杆菌[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇的组装均受到抑制。在15℃冷休克培养条件下，从存在不同程度铁硫簇组装障碍的大肠杆菌突变菌△iscU、△isc和△iscA△sufA中纯化的IscS都呈红色，且在528nm处也出现了特征性的吸收峰。　　6.2× LB和1×TB培养基联合15℃冷休克培养条件，都会促进红色IscS的产生　　25℃条件下，2× LB和1× TB培养基诱导纯化出来的大肠杆菌IscS均为黄色，而15℃条件下诱导的大肠杆菌IscS却为红色，且有528nm处的特征性吸收峰。发现15℃条件下只有增加培养基中酵母膏的含量才会促进大肠杆菌红色IscS的产生。　　7.红色反应物稳定性的分析　　将大肠杆菌IscS与L-半胱氨酸在体外孵育会导致IscS在395 nm处吸收峰消失，而红色IscS在528 nm处吸收峰却没有变化；当在反应体系中加入DTT以后，随着酶促反应的进行，红色IscS在528 nm处吸收峰也没有变化。　　8.红色反应物的生成依赖蛋白的活性且红色反应物会抑制半胱氨酸脱硫酶的活性　　全波长扫描结果发现纯化的含突变位点的蛋白均呈黄色，也无528nm的特征性吸收峰；且当冷休克条件下表达的红色IscS和野生型黄色IscS具有相同浓度和PLP结合量的情况下，发现红色蛋白的活性明显低于黄色蛋白。　　结论：　　1.构建的冷休克助溶型表达质粒pCold-SUMOa能够提高重组蛋白质EH-IscS的溶解度、活性和稳定性；　　2.发现在15℃冷休克培养条件下表达的重组半胱氨酸脱硫酶EH-IscS为淡红色，且随着时间的增加红色反应物会在大肠杆菌体内累积，冷休克培养条件可以促进红色蛋白的产生；　　3.25℃培养条件会抑制大肠杆菌[4Fe-4S]簇的组装，而不抑制[2Fe-2S]簇的组装，15℃培养条件下大肠杆菌[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇的组装均受到抑制，冷休克条件下，铁硫簇组装障碍的大肠杆菌突变菌纯化的IscS都呈红色，说明冷休克条件下该红色物质的产生与铁硫簇组装障碍有关；　　4.2× LB和1× TB培养基联合15℃冷休克培养条件，都会促进红色IscS的累积，并且进一步发现培养基中只有增加酵母膏含量才会促进红色IscS的累积；5.15℃冷休克条件下表达的含突变位点的蛋白没有变红也无528nm吸收峰，说明该红色反应物与蛋白的活性相关，只有有活性的蛋白才会有红色物质的产生；6.生理状态下，红色中间产物一旦形成就会稳定存在；当红色IscS和黄色IscS具有相同浓度和PLP结合量时，红色蛋白的活性明显低于黄色蛋白，说明该红色反应物可以抑制半胱氨酸脱硫酶的活性。