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目的:检测颗粒溶素(Granulysin,GRA)在不同病期的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者及健康对照组外周血淋巴细胞的表达水平,并同步测定血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、γ-干扰素(Interferon-gama,IFN-γ)和白细胞介素-2(Interleukin-2,II-2)浓度。分别比较颗粒溶素和TNF-α、IFN-γ、IL-2在不同病期的COPD患者及健康对照组中表达的差异性,及与上述三种细胞因子血清浓度的相关性。初步探讨COPD患者不同病期颗粒溶素表达特点以及和TNF-α、IFN-γ、IL-2之间的关系,颗粒溶素在COPD患者疾病发展变化过程中可能起到的作用及其意义。
方法:病人来源于泸州医学院附属医院呼吸内科住院患者(2006年3月-2006年6月),健康对照组均来自门诊健康体检者。清晨空腹抽取COPD患者急性发作期28例,临床缓解期26例,健康对照组23例静脉血10ml。取5ml肝素抗凝的静脉血,分离的淋巴细胞,并制成细胞涂片,采用即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(streptavidin-peroxidase,SP)_9003三步法免疫细胞化学技术操作,以新鲜配制的DAB-H2O2显色,苏木素复染,中性树胶封片。已知阳性细胞涂片作阳性对照,PBS液代替一抗作阴性对照。每个染色流程均设有对照以作为染色质量控制标准。以细胞浆内出现棕黄色颗粒者判为Granulysin阳性细胞。按每张涂片的阳性细胞比例及着色深浅划分为-、+、++、+++四级。基本不着色或着色细胞少于5%为阴性(-);着色浅淡或着色细胞占5%-25%为弱阳性(+);着色适中或着色细胞占26%-50%为中度阳性(++);着色深或着色细胞大于50%为强阳性(+++)。采用双抗体夹心ABC-ELISA法同步测定血清TNF-α、IFN-γ、IL-2浓度。在492nm处测OD值,TNF-α、IFN-γ、IL-2浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-α、IFN-γ、IL-2的浓度。应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析与统计学图表的绘制,采用X2检验、秩和检验及Spearman等级相关分析等统计方法对数据结果进行处理。P<0.05,有统计学意义。
结果:
①Granulysin在COPD患者及健康对照组的淋巴细胞中的阳性表达信号都主要位于细胞浆,54例COPD患者淋巴细胞中,其阳性表达51例,阴性表达3例,阳性表达率为94.44%(51/54)。其中,急性发作期的阳性表达率为96.43%(27/28),临床缓解期的阳性表达率为92.31%(24/26)。23例健康对照组淋巴细胞中,其阳性表达4例,阴性表达19例,阳性表达率为17.39%(4/23)。Granulysin在COPD患者和健康对照组淋巴细胞中的阳性表达率分别为94.44%、17.39%二者比较有显著统计学意义(P<0.01)。
②Granulysin在健康对照组的淋巴细胞中Granulysin呈低表达(4/23),在COPD患者临床缓解期多为中度阳性(17/26),急性发作期多为强阳性(22/28),其表达随着病情的变化而消长,三者比较有显著统计学意义(P<0.01)。
③COPD患者急性发作期血清TNF-α浓度为31.96±4.02 pg/ml,IFN-γ,浓度为26.83±6.02pg/ml,IL-2浓度为12.26±5.07pg/ml较临床缓解期和健康对照组显著增高(P<0.01)。临床缓解期血清TNF-α浓度为23.49±4.28pg/ml,IFN-γ,浓度为16.22±4.36pg/ml,IL-2浓度为7.23±3.41pg/ml均低于急性发作期,但仍高于健康对照组14.95±4.71 pg/ml,9.68±3.66 pg/ml。3.92±3.49pg/ml(P<0.05)。
④COPD患者急性发作期和临床缓解期 anulysin表达与血清TNF-α、IFN-γ,、IL-2浓度变化都呈正相关性,并随着病情变化存在明显消长关系,其相关系数分别为0.52和0.59、0.54和0.72、0.79和0.77均.P<0.05。
结论:
①Granulysin参与了COPD炎症过程,起着清除病原体的积极作用。其表达强度的消长与气道或/和肺部病原体的负荷量有关。
②TNF-α、IFN-γ、IL-2与Granulysin在消除病原体方面可能起着相互协同的作用,可能影响Granulysin的释放。
Granulysin在COPD不同病期均有表达,其表达强度与病原体的负荷量有关,在COPD病程中起着控制病原体生长,清除病原体的积极作用,是体内感染的免疫监测指标。Granulysin表达的增强和血清TNF-α、IFN-γ、IL-2浓度的增高呈正相关,可共同清除病原体,对Granulysin的释放可能起着促进的作用。