【摘 要】
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研究背景:心血管疾病已成为引起人类死亡的主要原因,线粒体在心肌细胞和心血管疾病中起重要作用。细胞器钙稳态机制研究是近年来细胞生物学研究的热点之一。其中,线粒体钙稳态失衡导致的线粒体功能障碍,是众多心血管疾病的重要病理生理机制。钙离子探针GCaMP家族是迄今为止应用最广泛的基因编码钙离子探针（GECIs）类型之一。但目前经典的GCaMP探针的长时间过度表达存在一定程度的诱导钙离子失调、异常的转录信号
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研究背景:心血管疾病已成为引起人类死亡的主要原因,线粒体在心肌细胞和心血管疾病中起重要作用。细胞器钙稳态机制研究是近年来细胞生物学研究的热点之一。其中,线粒体钙稳态失衡导致的线粒体功能障碍,是众多心血管疾病的重要病理生理机制。钙离子探针GCaMP家族是迄今为止应用最广泛的基因编码钙离子探针（GECIs）类型之一。但目前经典的GCaMP探针的长时间过度表达存在一定程度的诱导钙离子失调、异常的转录信号和细胞凋亡等问题。GCaMPX探针解决了有害的核积累、急性和慢性钙离子失调、异常的转录信号和细胞形态发生以及细胞凋亡等问题,同时仍显示出部分遗传自GCaMP的优秀钙离子感应特性。本研究拟构建一种以GCaMPX探针为基础的新型线粒体靶向钙离子探针,旨在优化线粒体钙稳态研究中探针工具对实验结果的影响。方法和结果:通过分子克隆技术,将线粒体靶向序列（mt-tag）克隆至GCaMPX质粒中,构建成新型线粒体靶向钙离子探针mt-GCaMPX。将上述重组质粒转染入H9C2细胞和293T细胞中并建成稳定表达细胞系。经共聚焦显微镜证实mt-GCaMPX的表达、线粒体存在共定位,准确靶向线粒体。同时,我们对mt-GCaMPX探针的钙离子浓度检测范围和线粒体Ca2+的特异性反应进行了评估。进一步在氧化应激细胞模型中使用200 umol/L H202 处理H9C2稳转细胞株后（mt-GCaMPX,mt-GCaMP6m,mt-GFP）,采用流式细胞仪检测各组细胞的mitoSOX和细胞凋亡水平。结果显示,与空白对照组和mt-GFP对照组（不带CaM）相比,mt-GCaMP6m组的线粒体氧化应激和细胞凋亡水平显著增高;而mt-GCaMPX组细胞的线粒体氧化应激和细胞凋亡水平显著低于mt-GCaMP6m组,与mt-GFP组相当下降;透射电镜观察和Western Blot检测（Caspase 3、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CaM）进一步证实了上述结果。结论:本实验构建了新型线粒体靶向钙离子探针mt-GCaMPX,具有良好的线粒体定位和线粒体Ca2+反应特性。在氧化应激条件下,mt-GCaMPX较经典的mt-GCaMP6m探针能够显著降低细胞凋亡和线粒体损伤,具有良好的实际应用价值。
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