目的:房颤是临床上最普遍存在的持续性心律失常。据Framingham心脏中心研究,成年人房颤发生率为每年4%,随着病人年龄增加,房颤的发生率也增加,25-35岁人群发生率少于0.05%,而大于69岁患者年发生率超过5%。房颤与发病率尤其与栓塞的发生密切相关,估计房颤患者每年中风发生率高达4.5%。房颤能降低活动耐量,也能因长期快速心律失常导致心肌病。电转复房颤在某些患者可能无效,如长时间的房颤、心房扩大、高龄、潜在疾患、高胸廓阻抗,在应用直流电转复时,约有20%的房颤患者会发生转复失败,或在数分钟内复发。因此临床中药物转复房颤对改善患者心功能及降低栓塞发生率具有重要意义。由于CAST实验已证实某些Ⅰ类抗心律失常药物可以增加心肌梗死患者的死亡率,在过去10年抗心律失常药物的研究热点已经从Ι类药物转移至Ⅲ类药物。近年来研究表明新型III类抗心律失常药物-伊布利特,在多数临床试验中证明有快速转复房颤、房扑的作用而成为治疗心律失常的主要药物之一。目前国内外已对伊布利特的电生理作用做了大量研究,证实伊布利特通过抑制复极时K+外向电流(Ikr),促进平台期缓慢内向Na+电流,促进平台期内向Ca2+内流,从而延长动作电位(APD)时程和有效不应期(ERP)来终止折返激动。国内外对伊布利特离子通道的研究集中在各种K+电流、Ca2+电流及缓慢内向Na+电流,而对快钠离子通道的研究未见相关报道。国外有相关实验证实加入钠通道拮抗剂河豚毒(TTX)后不能缩短伊布利特所延长的APD及ERP,但这不能说明伊布利特对快钠离子通道没有影响。本研究以酶解法分离新西兰大白兔心房细胞,采用全细胞膜片钳记录技术直接记录不同浓度伊布利特对心房细胞快钠通道的影响,从而探讨其抗房颤/房扑的部分离子通道机制。材料与方法1实验动物:新西兰纯种大耳白兔40只,由河北医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体质量1.5～2.0kg。随机抽取10只兔作为正常对照组(Con),10只兔作为伊布利特10-7mol/L浓度组(10-7),10只兔作为伊布利特10-6mol/L浓度组(10-6), 10只兔作为伊布利特10-5mol/L浓度组(10-5)。2细胞分离:利用酶解(胶原酶I,Sigma公司)的方法分离心房肌细胞,四组细胞均来源于心房细胞。3给药方法:分别把伊布利特纯品(由北京红惠生物制药股份有限公司提供)溶解于INa细胞外液中使伊布利特终浓度达到10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L,分别用含有不同浓度伊布利特的细胞外液灌流细胞,流速2m1/min,大约3～5分钟。4电流记录:应用膜片钳全细胞记录方法,记录对照组及伊布利特三个浓度组干预下心房细胞INa活性的变化,包括INa I-V曲线、稳态失活曲线及失活后再恢复曲线,并与正常对照组进行比较分析。电流记录的刺激程序由pulse+ pulsefit软件控制,通道信号经EPC-9膜片钳放大器放大,通过Ag-AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞,产生的电流信号经EPC-9转换,为pulse+ pulsefit软件采集、分析。5统计学分析:应用SPSS 10.0软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,首先进行组间均衡性检验,两组计量资料采用t检验,成组资料间比较采用方差分析,率(%)的比较用χ2检验,以P<0.05为有显著性差异的标准。结果1伊布利特对兔心房细胞INa I–V曲线的影响观察正常对照组、伊布利特三个浓度组(10-7、10-6、10-5 mol/L)心房细胞所记录的原始INa电流形态曲线。四组细胞INa的I–V曲线,均在–70mV激活,–20mV达峰值,+50mV时反转。应用伊布利特干预组与对照组相比,I–V曲线上移,变化呈浓度依赖性,以伊布利特10-5mol/L浓度组上升最明显,但INa电压依赖性不变,对激活电位、峰值电位、反转电位及I-V曲线的形态轨迹均无影响。INa峰值电流密度(–20mV)的比较显示:对照组为–87.12±4.67pA/pF(n=12 cells),伊布利特10-7mol/L浓度组为–68.82±4.43 pA/pF(n=14 cells),峰值电流密度较对照组下降了21.01%,P<0.05;伊布利特10-6mol/L浓度组INa峰值电流密度为–45.26±3.46pA/pF(n=11 cells),较对照组下降了48.05%,P<0.01;伊布利特10-5mol/L浓度组INa峰值电流密度为–33.46±3.11pA/pF(n=11 cells),较对照组下降了61.59%,P<0.01。伊布利特三个浓度组较对照组均有明显下降,P<0.05。伊布利特三个浓度组之间比较显示三组间有显著差异且呈浓度依赖型。2伊布利特对兔心房细胞INa稳态失活曲线的影响INa电压依赖性稳态失活曲线,伊布利特三个浓度组(10-7、10-6、10-5mol/L)与正常对照组相比,失活曲线明显左移(即向超极化方向移动),以伊布利特10-5 mol/L浓度组左移最明显。V0.5对照组为–78.6±4.1mV(n=10 cells),伊布利特10-7mol/L浓度组为–92.7±4.2mV(n=11 cells),与对照组比较有显著性差异,P<0.01;伊布利特10-6mol/L浓度组V0.5为–103.3±4.5mV(n=10 cells),与对照组和伊布利特10-7mol/L浓度组比较均有显著性差异,P<0.05;伊布利特10-5mol/L浓度组V0.5为–115.1±4.6mV(n=11 cells),与对照组和伊布利特10-7mol/L浓度组及伊布利特10-6mol/L浓度组比较均有显著性差异,P<0.05。3伊布利特对兔心房细胞INa失活后再恢复曲线的影响四组细胞INa失活后再恢复过程,当两个脉冲间隔时间为15ms时,对照组INa恢复62%,伊布利特10-7 mol/L浓度组恢复40%,伊布利特10-6mol/L浓度组恢复19%,伊布利特10-5mol/L浓度组恢复2%;而当两个脉冲间隔时间为75ms时,对照组恢复100%,伊布利特10-7mol/L浓度组恢复85%,伊布利特10-6mol/L浓度组恢复58%,伊布利特10-5mol/L浓度组恢复37%。说明伊布利特三个浓度组(10-7、10-6、10-5mol/L)INa再恢复明显减慢,再恢复时程延长,和对照组比较有显著性差异,分别为P<0.05、P<0.01、P<0.001;伊布利特三个浓度组之间比较均有明显差异,P<0.05。结论1本课题通过研究伊布利特三个浓度组(10-7、10-6、10-5 mol/L)对心房细胞快钠离子通道电流的变化,并与正常对照组相比。结果显示,伊布利特干预后心房细胞INa电生理特性发生了一系列变化,如INa电流活性降低,INa电流-电压曲线(I-V曲线)上移,INa电压依赖性稳态失活曲线左移,INa失活后再恢复时间延长。显示伊布利特抑制心房细胞0相快钠电流,心肌细胞膜离子通道的异常活动,可引起膜电位降低、动作电位0位相上升速率下降、动作电位时程及心房有效不应期延长,减慢传导终止折返,这可能是伊布利特抗房性心律失常的部分离子通道机制。2伊布利特三个浓度组(10-7、10-6、10-5mol/L)相比较,伊布利特10-5mol/L对INa的抑制作用最明显。伊布利特三个浓度组相比,INa I-V曲线、INa稳态失活曲线、INa失活后再恢复曲线的变化有统计学意义,提示伊布利特的药理作用在一定范围内呈现浓度依赖性,INa电压依赖性稳态失活曲线左移,说明该药物的作用也呈电压依赖性。3国内外有研究报道伊布利特对心房肌细胞动作电位平台期缓慢内向钠电流有促进作用,而本研究表明伊布利特对心房肌细胞动作电位0相快钠电流有抑制作用。4该研究表明了III类抗心律失常药物-伊布利特可能具有的抗房性心律失常的部分离子通道机制。5各离子通道不是孤立存在的,心房肌动作电位的形成也是各通道平衡的结果,因此推测伊布利特干预后,快钠通道活性改变是否会影响其他离子流活性,尚需进一步研究。