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研究背景:炎症与多种临床疾病的发病机制密切相关,包括心血管疾病、1型糖尿病、2型糖尿病及其并发症等。糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性炎症疾病。高血糖和炎性因子表达的增加都会诱发炎症反应,而炎症的发生和发展过程与线粒体密切相关。脓毒症是一种全身性炎症反应性疾病,脂多糖(LPS)被广泛用于诱导心肌细胞炎症和凋亡反应,是诱导细胞脓毒症模型的常用药物。心肌细胞产生的促炎性因子和凋亡在心肌功能障碍的发病机制中至关重要。二甲双胍(Met)具有降血糖和抗炎作用,在多种组织中表现出了抗氧化特性和降低脂质氧化的作用。此外,二甲双胍已经被证明可直接作用于线粒体,保护细胞。目前已知,线粒体可以通过活性氧(ROS)水平、自噬、线粒体的分裂和融合等方面调控炎症的发生。线粒体脂肪酸合成通路Ⅱ(mtFAS Ⅱ)是线粒体功能的重要组成部分,其终产物是硫辛酸(lipoic acid,LA),硫辛酸是蛋白脂酰化反应的主要原料。脂酰化是催化葡萄糖、氨基酸等分解代谢的多种酶的活化所必需的。因此,mtFAS Ⅱ功能的维持是线粒体功能维持的必要条件。目前在炎症状态中mtFAS Ⅱ的变化及其在治疗炎症中的意义还未有研究,因此,本课题将研究不同炎症状态中线粒体脂肪酸合成通路Ⅱ的变化及在二甲双胍治疗心肌炎症中的意义。研究目的:探究mtFAS Ⅱ在多种炎症状态中的变化及其在二甲双胍治疗心肌细胞炎症中的变化及意义。研究内容和方法:本课题主要研究了在肿瘤坏死因子-α、高糖两种炎症状态中,mtFAS Ⅱ的变化,以及在脂多糖诱导的炎症状态下,mtFAS Ⅱ的变化及经二甲双胍治疗后的变化和意义。在肿瘤坏死因子-α和高糖诱导的炎症中,研究mtFAS Ⅱ中丙二酰-CoA/ACP转移酶(MCAT)、3-酮脂酰-ACP合成酶(OXSM)、硫辛酸合成酶(LIAS)和丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)的E2亚基(PDCE2)脂酰化变化。(1)用10ng/mL的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导炎症状态,按相应的时间梯度处理3T3-L1前脂肪细胞,检测mtFASⅡ中MCAT、OXSM、LIAS的mRNA水平和OXSM的蛋白水平;在DIO肥胖小鼠中,检测在TNF-α高表达的脂肪组织炎症状态下,OXSM的mRNA水平变化。(2)用35mM葡萄糖(D-glucose)诱导炎症状态,按相应的时间梯度处理3T3-L1前脂肪细胞,检测在高糖炎症状态下,MCAT、OXSM、LIAS的mRNA水平和OXSM的蛋白水平;在STZ糖尿病模型小鼠和db/db糖尿病模型小鼠肾脏组织中,分别检测MCAT、OXSM、LIAS的mRNA水平以及STZ糖尿病模型小鼠肾脏组织中MCAT、OXSM、LIAS蛋白水平和PDCE2脂酰化水平变化。在LPS诱导的心肌细胞炎症中,研究mtFAS Ⅱ中MCAT、OXSM、LIAS和PDCE2蛋白脂酰化水平的变化,及其在二甲双胍治疗后的变化。本实验将分为对照组、LPS诱导H9C2型心肌细胞炎症组及3种不同浓度Met与LPS联合治疗组。采用MTT法测定各组细胞活力,流式细胞技术检测各组细胞的凋亡和活性氧水平,蛋白质印记法检测各组的Caspase3、BCL2、BAX、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(PAMPK)、腺苷酸活化蛋白激酶(t-AMPK)、Beclin1、Parkin和mtFAS Ⅱ中MCAT、OXSM、LIAS蛋白水平和脂酰化水平。结果:(1)在TNF-α诱导的炎症状态中,MCAT和LIAS的mRNA水平均出现了短暂性的降低,而OXSM的mRNA水平出现了下降趋势(P<0.05),并且其蛋白表达也出现了持续性的下降,在24h达到最低值(P<0.001)。在TNF-α高表达的DIO小鼠脂肪组织中,OXSM的mRNA水平发生了极其显著的下降(P<0.001)。(2)在高糖诱导的炎症状态中,MCAT、OXSM、LIAS的表达在mRNA水平上发生了短暂性降低,最终恢复到了正常水平。在蛋白水平上,OXSM表达下降,在4h达到最低(P<0.001),在24h时虽有所恢复,但仍低于正常水平。在STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏组织中,MCAT、LIAS的mRNA水平都发生了显著下降(P<0.01),但OXSM的mRNA水平不变。在db/db糖尿病小鼠模型肾脏组织中,MCAT、OXSM、LIAS的mRNA水平都发生了显著下降。在STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏组织中,OXSM的蛋白水平和PDCE2脂酰化水平发生了极其显著的下降(P<0.001)。(3)在LPS诱导的心肌细胞炎症组中,心肌细胞的凋亡和ROS水平发生了显著升高(P<0.01),自噬相关蛋白、mtFAS Ⅱ中OXSM、LIAS蛋白和PDCE2蛋白的脂酰化水平都发生了显著的下降(P<0.01)。在Met治疗组中,细胞凋亡率和活性氧水平显著下降(P<0.01),自噬相关蛋白Beclin1和Parkin以及P-AMPK的蛋白表达以及OXSM和LIAS蛋白水平和PDCE2蛋白脂酰化水平显著增加(P<0.01)。结论:TNF-α、高糖和LPS诱导的炎症都会抑制mtFAS Ⅱ中酶的表达和PDCE2蛋白脂酰化水平。二甲双胍能明显改善炎症引起的mtFAS Ⅱ中酶表达水平,减少对心肌细胞的损伤,减少细胞凋亡。