研究背景与方法大量的研究表明,糖皮质激素对胎儿的生长发育具有非常重要的作用。妊娠晚期适量的糖皮质激素能够促进胎儿器官的发育和成熟,尤其是胎儿的肺器官,而妊娠期过量的糖皮质激素不但能引起胎儿宫内发育迟缓而且还可以编码成人疾病的发生。妊娠期,胎儿的肾上腺结构和功能与成年人的相差较大,只生成少量的糖皮质激素,而母体肾上腺糖皮质激素的分泌随孕期逐渐增加。研究表明,糖皮质激素虽然为脂溶性激素,但在妊娠期,母体侧与胎儿侧仍然存在一个约为10：1的糖皮质激素浓度差,这个浓度差的建立主要归功于胎盘糖皮质激素屏障,此屏障主要由胎盘的合体滋养层细胞组成,物质基础是11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ型(11β-Hydroxysteroid dehydrogenase type2,11β-HSD2),其作用是将具有生物活性的糖皮质激素皮质醇(cortisol, F)脱氢氧化为没有生物活性的17-羟-11-脱氢皮质酮(可的松,cortisone, E)。因此,在妊娠期,足量的11β-HSD2能够将母体来源的过量皮质醇失活,从而避免胎儿暴露在过量的糖皮质激素环境中,保证胎儿正常地生长发育。胎盘绒毛小叶的滋养层细胞主要分为合体滋养层细胞与细胞滋养层细胞。已有研究证明,合体滋养层细胞中大量表达11β-HSD2,而细胞滋养层细胞作为合体滋养层细胞的前体只有少量的11β-HSD2表达。细胞滋养层细胞向合体滋养层细胞分化融合过程中,11β-HSD2通过何种分子机制得到大量表达尚未阐明,此分子机制的阐明对于认识宫内发育迟缓发生的机制和优生优育具有重要的理论和临床意义。本课题采用人类胎盘组织,通过免疫组织化学染色、体外胎盘滋养层细胞培养、细胞免疫染色、重亚硫酸盐修饰后克隆测序、实时荧光定量PCR、Western Blotting、小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)转染、蛋白过表达载体转染、染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, coIP)等技术,研究了人类胎盘细胞滋养层细胞合体化过程中11β-HSD2表达上调的分子机制。研究结果1.人胎盘组织的免疫组织化学染色结果表明,11β-HSD2主要在胎盘绒毛小叶的合体滋养层中大量表达,而绒毛小叶内的细胞滋养层细胞、间质细胞和胎儿血管几乎无表达。此外,通过细胞免疫染色、实时荧光定量PCR和Western Blotting的方法研究发现,11β-HSD2的mRNA和蛋白水平随着细胞滋养层细胞向合体滋养层细胞的分化而不断增加。2.通过生物信息学分析发现,11β-HSD2的基因启动子上富含CG序列、存在两个典型的CpG岛。以往的研究发现,DNA甲基化是导致11β-HSD2在人体不同组织中表达差异的主要原因,而且低表达11β-HSD2的组织中,11β-HSD2启动子上-244bp至+16bp的甲基化程度很高,且这一位置又处于主要调控11β-HSD2表达的启动子序列中。因此,我们采用重亚硫酸盐修饰后克隆测序的方法来检测11β-HSD2基因启动子序列-244bp至+16bp范围内的DNA是否在细胞滋养层细胞合体化过程中发生了去甲基化,结果发现,细胞滋养层细胞与合体滋养层细胞在11β-HSD2基因启动子-244bp至+16bp序列范围内虽然个别碱基存在甲基化的现象,但这个范围内大部分位置的胞嘧啶序列并没有甲基化的区别,此结果提示,在滋养层细胞合体化过程中,11β-HSD2基因启动子-244bp至+16bp序列的甲基化程度的变化可能不是胎盘滋养层细胞合体化过程中11β-HSD2表达大量增加的原因。3.我们实验室以往的研究表明,人绒毛膜促性腺激素(hCG)能够通过cAMP途径维持人胎盘合体滋养层细胞中11β-HSD2的表达,于是,我们用cAMP的类似物dbcAMP以及腺苷酸环化酶的激动剂Forskolin处理胎盘合体滋养层细胞。实时荧光定量PCR和Western Blotting的检测结果表明,dbcAMP和Forskolin都能够显著提高合体滋养层细胞中11β-HSD2的表达,此结果提示,在胎盘合体滋养层细胞中,cAMP途径参与了11P-HSD2的表达调控。4.以往的研究表明,转录因子Sp1主要结合在CG含量高而且密集的基因启动子上,于是我们对Sp1是否参与胎盘滋养层细胞11β-HSD2的表达进行了研究。免疫组织化学染色发现,Sp1与11β-HSD2的分布一致,主要出现在胎盘绒毛小叶的合体滋养层中,而在细胞滋养层和其它部位只有少量的分布。进一步利用细胞免疫染色、实时荧光定量PCR、Western Blotting以及染色质免疫沉淀(ChIP)的方法研究发现,Sp1的表达以及Sp1与11β-HSD2基因启动子的结合也都是随着细胞滋养层细胞的合体化而不断增加的。接下来,我们利用实时荧光定量PCR和Western Blotting的方法研究发现,dbcAMP和Forskolin能够促进合体滋养层细胞中Sp1的表达。上述结果提示,在cAMP途径调控11β-HSD2表达的过程中,转录因子Sp1可能起着非常重要的作用。于是,我们以胎盘合体滋养层细胞为研究模型研究了Sp1在cAMP途径调控11β-HSD2表达过程中的重要性,研究结果表明,Sp1的拮抗剂光神霉素A (Mythramycin A, M)和Sp1的siRNA不仅能够抑制11β-HSD2的基础表达,而且还能够抑制dbcAMP和Forskolin对11β-HSD2表达的促进稚用。进一步用ChIP方法研究发现,dbcAMP和Forskolin不仅能够促进Sp1、RNA聚合酶II(RNA polymerase II, Pol II)与11β-HSD2基因启动子的结合,而且还能够增加11β-HSD2基因启动子上H3K9(histone3lycine9)的乙酰化水平,此结果提示,Sp1在11β-HSD2的基础表达以及cAMP途径激活导致的11β-HSD2表达调控中起着非常重要的作用,此外,组蛋白的乙酰化也可能参与了胎盘滋养层细胞中11β-HSD2表达的调控。5.前人的研究表明,Sp1能够与具有乙酰转移酶活性的p300相结合形成一个蛋白复合物从而调控一些基因的表达,因此,我们研究了p300在人胎盘滋养层细胞中是否参与了11β-HSD2表达的调控作用。通过免疫组织化学方法研究发现,p300在人胎盘中的分布与Sp1和11β-HSD2的分布一致,在胎盘绒毛小叶的合体滋养层上大量分布,而在细胞滋养层和其它部分的分布很少。细胞免疫染色的结果表明,在细胞滋养层细胞合体化过程中,细胞核内出现p300,此结果说明,在胎盘滋养层细胞中,p300可能作为一个核蛋白发挥作用。用实时荧光定量PCR、Western Blotting和ChIP的方法研究发现,p300的表达以及p300与11β-HSD2基因启动子的结合随着细胞滋养层细胞的合体化而增加。同时,Western Blotting和ChIP的结果还表明,acetyl-H3K9和acetyl-H3K27(histone3lycine27)的蛋白水平以及它们与11β-HSD2基因启动子的结合量也是随细胞滋养层细胞的不断合体化而增加。上述结果提示,在细胞滋养层细胞合体化过程中,p300可能通过乙酰化组蛋白3(Histone3,H3)来调控11β-HSD2的表达。另外,我们利用实时荧光定量PCR和Western Blotting的方法研究发现,p300的表达与Spl一样也能够被dbcAMP和Forskolin上调。因此,我们利用p300的拮抗剂C646和siRNA转染下调p300表达来研究p300在cAMP途径对11β-HSD2表达调控中的作用。研究发现,C646和p300siRNA不仅能够抑制11β-HSD2的基础表达,而且还能抑制dbcAMP对11β-HSD2的促进作用。进一步通过ChIP的方法我们证实,C646和p300siRNA还可以下调11β-HSD2基因启动子上H3K9和H3K27乙酰化水平。此外,转染表达p300质粒(pCI-p300)的实验发现,滋养层细胞过表达p300蛋白能够增加11β-HSD2的mRNA和蛋白水平。综上所述,在人胎盘滋养层细胞合体化过程中,p300可以通过乙酰化hisone3来调控11β-HSD2的表达。接下来,我们利用coIP的方法检测了在人胎盘合体滋养层细胞中,Spl与p300是否也能够相互结合形成蛋白复合体,结果表明,Sp1存在于由p300抗体沉淀的蛋白复合物中；而且ChIP和reChIP (re-chromatin immunoprecipitation)的结果也显示Sp1和p300能够与11β-HSD2基因启动子的同一片段结合,并且它们的结合量都能被dbcAMP和Forskolin处理所增加。为了进一步证明Sp1能够与p300一起协同调控11β-HSD2的表达,我们在滋养层细胞中同时转染pCI-p300和Sp1siRNA,结果发现过表达p300蛋白对11β-HSD2的促进作用能够被Spl siRNA所削弱。上述结果提示,Spl与p300能够协同调控人胎盘滋养层细胞中11β-HSD2的表达。结论我们的研究结果表明,在胎盘滋养层细胞向合体滋养层细胞分化过程中11β-HSD2的表达量增加,至少与11β-HSD2基因启动子-244bp-+16bp区域的甲基化程度无关。此外,我们的研究还表明,在人胎盘组织中,11β-HSD2、Sp1和p300主要在绒毛小叶的合体滋养层中表达。随着细胞滋养层细胞向合体滋养层细胞不断分化,cAMP途径被激活,p300和Spl蛋白表达增加,随后,它们在11β-HSD2基因启动子上形成转录共激活子,乙酰化11β-HSD2基因启动子上组蛋白H3K9和H3K27,进而上调11β-HSD2的表达。