菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一,具有很高的观赏价值与经济价值。但菊花在生长过程中常会遭受各种非生物胁迫,其中干旱作为一种重要的逆境因子严重影响菊花的生长发育和产品品质。GRAS和TCP类转录因子参与植物生长发育和抗性胁迫等多个方面,但是目前菊花中关于这两类转录因子在干旱胁迫方面的功能研究鲜见报道。本研究旨在克隆这两类转录因子并分析它们响应干旱胁迫的分子机理,为菊花耐旱基因挖掘与耐旱育种奠定基础。主要内容及结论如下:1.克隆得到了 1个GRAS类基因,通过序列分析和系统进化树分析发现这个GRAS基因属于AtSCL4/7亚家族,因此将其命名为CmSCL4。20%PEG6000模拟干旱处理发现CmSCL4具有先上升后下降的表达趋势,并且在处理后3 h表达量达到最高。克隆了CmSCL4的启动子,分析顺式作用元件后发现CmSCL4启动子上具有多个干旱诱导的MYB蛋白结合位点。组织定量显示CmSCL4在茎中的表达量较高。亚细胞定位发现CmSCL4定位在细胞核。酵母单杂交实验表明:CmSCL4具有转录激活活性。2.构建了 CmSCL4的植物遗传转化载体pMDC43-CmSCL4和pSRDX-CmSCL4,采用花序侵染法将pMDC43-CmSCL4载体转化拟南芥获得超表达株系,采用农杆菌介导的叶盘侵染法将pMDC43-CmSCL4和pSRDX-CmSCL4载体转化菊花‘神马’,获得超表达和融合抑制株系。干旱处理拟南芥发现,转基因株系在干旱复水后具有更高的存活率,并且在12 h内的失水率低于野生型。ABA合成及响应相关基因定量分析发现,只有ABA信号路径的较下游基因AtABI3和AtABI4在表达量上有明显变化,具体表现为在自然条件和干旱失水6 h时,转基因株系中这两个基因的表达量都显著高于野生型。在1/2 MS板上转基因株系和野生型的种子萌发和早期幼苗生长没有明显差异,而在含有0.1 μmol的ABA板上,转基因株系的种子萌发和早期幼苗生长都明显受到抑制,表明转基因CmSCL4提高了拟南芥对ABA的敏感性。20%PEG6000处理转基因‘神马’发现,超表达株系的叶片损伤率低于野生型,而融合抑制株系的叶片损伤较对照严重。处理3d后叶片的相对含水量也是融合抑制株系的最低,野生型次之,超表达株系最高。12 h内基因定量分析结果表明,在超表达株系中CmABI4基因的表达量高于野生型,而融合抑制株系中CmABI4基因表达量最低。以上结果表明CmSCL4可能是通过调控CmABI4等基因的表达来正向调控菊花的耐旱性。3.为了进一步研究CmSCL4参与干旱胁迫的分子机理,我们获得了 CmSCL4没有转录激活活性的区段CmSCL4(181-561 aa),并进行了酵母双杂交筛库研究。根据转录组数据并结合RACE技术克隆到了 CmSCL4互作蛋白CmR1MYBl转录因子全长,序列分析发现其具有一个MYB-CC和SANT结构域。20%PEG6000模拟干旱处理发现CmR1MYB1具有和CmSCL4相似的先上升后降低的表达趋势,并且在3 h时表达量达到最高,除此之外,CmR1MYB1还具有和CmSCL4相似的组织表达模式。进一步通过酵母双杂、洋葱和烟草BiFC以及pull-down实验验证了两者互作。并在酵母系统中发现CmSCL4和CmR1MYB1的MYB-CC区段存在互作而与SANT区段不互作。构建了 pMDC43-CmR1MYB1的遗传转化载体并转化拟南芥和菊花‘神马,。发现,超表达CmR1MYB1的拟南芥对ABA更为敏感,并且提高了耐旱性。拟南芥中定量结果显示ABA响应基因AtABI3、AtAB14在转基因株系中都发生了明显上调,而AtABI1、AtABI2、AtABI5表达量没有明显变化。在20%PEG6000处理下野生型‘神马’萎蔫程度较转基因株系严重,并且转基因株系中CmAB14基因的表达量显著高于野生型。以上结果表明CmSCL4和CmR1MYBl互作通过依赖于ABA的途径来正向调控菊花的耐旱性。4.根据转录组数据并结合RACE技术克隆得到了一个TCP类转录因子,序列分析和系统进化树分析后将其命名为CmTCP14。20%PEG6000干旱处理发现CmTCP14具有先降低后升高的表达趋势,并且在处理3 h时表达量达到最低。组织定量显示CmTCP14在茎中的表达量最高,在舌状花中的表达量最低。亚细胞定位表明,CmTCP14定位在细胞核。酵母单杂交结果显示:CmTCP14没有转录激活活性。构建pMDC43-CmTCP14植物表达载体并转化拟南芥,发现转基因株系的耐旱性增强,且具有晚花、花期延长和衰老推迟等表型。为了进一步明确CmTCP14参与耐旱及其它生命过程的分子机理,我们进行了酵母双杂交筛库,获得了 4个CmDELLA基因片段。进一步对它们转录活性和亚细胞定位进行研究,发现这4个CmDELLAs都具有转录激活活性并且主要定位在细胞核,为之后深入研究CmTCP14和CmDELLAs互作共同调控菊花耐旱等过程奠定了基础。