众所周知,脑卒中是导致患者神经功能障碍的重要原因之一,其发病率、致残率、死亡率和复发率呈逐年升高趋势。尽管溶栓疗法是治疗阻塞性脑卒中的一种有效治疗方式,但由于治疗时间窗狭窄,以及rt-PA等溶栓药物存在各种副作用,目前仅有3-5%患者能够接受治疗并可能从中受益。因此,脑卒中仍是威胁人类生命和生活质量的重大疾患。脑缺血再灌注后线粒体参与了内环境中一系列复杂的变化,包括钙稳态的调节,活性氧自由基的产生,细胞内各种信号通路的活化等。研究证实,线粒体不断地进行着生物发生、自噬、融合与分裂等动态变化,这对保证线粒体的新老交替和维持线粒体的正常功能起到重要作用。其中线粒体生物发生不仅增加了细胞中线粒体的数量和质量,满足细胞对能量的需求,还可以促进脑缺血损伤后神经元的恢复,改善神经元功能。已有大量研究证实,脑缺血状态下,线粒体生物发生是一个内源性神经保护反应,诱导线粒体生物发生是一个新的神经保护策略。同时,有研究表明抑制糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)能够促进线粒体的生物发生,减少缺血引起的脑损伤,而激活大麻素受体1(CB1R)可以促进GSK-3β第9位丝氨酸的磷酸化,即使其失活。然而,内源性大麻素系统在脑缺血-再灌注后对线粒体生物发生的影响如何,目前尚不清楚。因此,本实验旨在探索cb1r特异性激动剂acea(arachidonyl-2-chloroethyl-amide)是否通过gsk-3β诱导线粒体生物发生,从而发挥脑保护作用。为此,我们展开以下研究。研究一:cb1r特异性激动剂acea减轻脑缺血损伤【目的】研究acea对大鼠脑缺血损伤的治疗作用及其最佳有效剂量。【方法】成年雄性sd大鼠70只,随机分为5组,在脑缺血再灌注后1h腹腔注射生理盐水(vehicle组)或不同浓度的acea(0,0.5,1,2mg/kg),通过ttc染色(n=8)、神经行为学评分(n=6)对大鼠脑功能进行评估。另取成年雄性sd大鼠20只,随机分为四组:sham,mcao,acea和vehicle组,使用tunel染色(n=5)的方法,观察acea是否减少凋亡神经元的数量。【结果】与vehicle组相比,1mg/kg和2mg/kg的acea能够明显减少大鼠脑梗死体积(p<0.05),并且提高了大鼠神经行为学评分(p<0.05)。因此,在后续实验中选取1mg/kg这个最低有效剂量作为治疗剂量。tunel染色结果显示给予acea后明显减少神经元凋亡数量(p<0.05),单纯给予vehicle则没有这种作用。【结论】acea具有治疗脑缺血损伤的作用,且其最佳有效剂量为1mg/kg。研究二:acea促进线粒体生物发生并改善线粒体功能减轻脑缺血损伤【目的】观察acea对脑缺血损伤后线粒体生物发生相关分子、线粒体数量和体积以及线粒体功能的影响。【方法】1.为研究acea对线粒体生物发生相关分子的影响,将雄性sd大鼠56只,随机分为sham组和mcao组,其中mcao组再随机分为6组,即mcao2h、acea2h、mcao4h、acea4h、mcao24h、acea24h,在缺血再灌注后2h,4h,24h取缺血半暗带脑组织,westernblot检测nrf-1,tfam和coxiv等线粒体生物发生相关分子(n=4)。在缺血再灌注后4h取脑组织进行免疫荧光染色,检测nrf-1,tfam和coxiv等线粒体生物发生相关分子(n=4)。2.为研究acea对线粒体数量和体积的影响,将雄性sd大鼠9只,随机分为假手术sham组和mcao组,其中mcao组再随机分为2组,即给予acea和不给acea(mcao组),在缺血再灌注后4h取脑组织,通过透射电镜观察线粒体数量和体积的变化。3.为研究acea对线粒体功能的影响,培养原代神经元,建立ogd模型模拟脑缺血损伤,通过ldh释放试验和cck-8检测细胞活力筛选出acea治疗损伤神经元的最佳有效剂量,然后根据此剂量检测线粒体的各项功能。我们将细胞分为4组:control组、ogd组、acea组和vehicle组,acea组为复氧复糖即刻给予acea,vehicle组为复氧复糖即刻给予溶剂。通过检测三磷酸腺苷(atp),线粒体膜通透转化孔(mptp),线粒体膜电位(mmp),丙二醛(mda)和活性氧(ros)的含量,对线粒体的功能进行评估,最后通过流式细胞检测神经元存活情况。【结果】1.westernblot结果显示mcao后2h和4h,acea可上调nrf-1的表达(p<0.05);在给予acea后2h,4h和24h,上调tfam和coxiv表达(p<0.05)。免疫荧光染色结果显示给予acea后4h,nrf-1,tfam和coxiv的表达都明显上调(p<0.05)。2.透射电镜结果显示给予acea可以显著增加线粒体的数量(p<0.05),增大线粒体体积(p<0.05),说明acea促进新线粒体的生成。3.与vehicle组相比,acea能够促进atp的生成(p<0.05),提高线粒体膜电位(p<0.05),减少线粒体膜通道转化孔的开放(p<0.05),减少ros(p<0.05)和mda的生成(p<0.05),从而改善了线粒体的功能。流式细胞计数显示acea明显减少ogd引起的神经元凋亡数量(p<0.05)。【结论】acea能够促进线粒体的生物发生,改善线粒体的功能,从而发挥神经保护作用。研究三:gsk-3β参与acea促进线粒体生物发生并改善线粒体功能的作用【目的】研究gsk-3β不同磷酸化水平对acea促进线粒体生物发生和改善线粒体的功能的影响。【方法】1.为检测脑缺血后gsk-3β及其磷酸化水平的变化,将雄性sd大鼠20只,随机分为sham组和mcao组,其中mcao组再随机分为4组:即mcao2h、acea2h、mcao4h和acea4h,在脑缺血再灌后2h,4h取缺血半暗带脑组织(n=4),westernblot检测gsk-3β及其磷酸化水平变化。2.研究抑制gsk-3β磷酸化对线粒体生物发生的影响,将雄性sd大鼠28只,随机分为sham组和mcao组,其中mcao组再随机分为6组,即mcao、acea、acea+wrt、acea+vehicle(w)、acea+ly和acea+vehicle(l),wrt和ly为pi3k的两个抑制剂,它们可以阻断gsk-3β的磷酸化。在脑缺血再灌注后4h取缺血半暗带脑组织,通过westernblot检测线粒体生物发生的标记分子物nrf-1,tfam和coxiv的表达情况。3.研究促进gsk-3β磷酸化对线粒体生物发生的影响,将雄性sd大鼠20只,随机分为sham组和mcao组,其中mcao组再随机分为4组:即mcao、acea、acea+vehicle(t)和tdzd-8,tdzd-8为gsk-3β抑制剂,它可以模拟gsk-3β处于其磷酸化状态。在脑缺血再灌注后4h取缺血半暗带脑组织,通过westernblot检测线粒体生物发生的标记分子物nrf-1,tfam和coxiv的表达情况,观察促进gsk-3β磷酸化能否影响线粒体生物发生。4.为研究gsk-3β磷酸化对线粒体功能的影响,培养原代神经元,建立ogd模型模拟脑缺血损伤,在给予acea的基础上使用pi3k抑制剂wrt和ly或gsk-3β抑制剂tdzd-8,检测atp,mptp,mmp,mda和ros的含量,对线粒体的功能进行评估。【结果】1.大鼠在脑缺再灌注后2h和4h,gsk-3β的表达含量无明显变化,但gsk-3β的磷酸化水平显著增高(p<0.05)。2.westernblot结果显示,与vehicle相比,抑制gsk-3β向其磷酸化转变,线粒体生物发生相关分子nrf-1,tfam和coxiv的表达下降(p<0.05)。3.westernblot结果显示,与vehicle相比,促进gsk-3β向其磷酸化转变,线粒体生物发生相关分子Nrf-1,Tfam和COX IV的表达升高(P<0.05)。4.在原代神经元上进一步证实,促进GSK-3β向其磷酸化转变,能够促进ATP的生成(P<0.05),提高线粒体膜电位(P<0.05),减少线粒体膜通道转化孔的开放(P<0.05),减少ROS(P<0.05)和MDA(P<0.05)的生成,从而改善了线粒体的功能。反之,抑制GSK-3β磷酸化降低线粒体功能。【结论】ACEA通过调节GSK-3β磷酸化促进线粒体的生物发生并改善线粒体功能,从而发挥脑保护作用。ACEA激活CB1R是促进线粒体生物发生的始动因素,调节GSK-3β磷酸化是ACEA控制线粒体生物发生的关键环节,为脑卒中治疗提供新的药物靶点,也将为脑卒中治疗提供新途径。