肺癌是全球和我国死亡率最高的恶性肿瘤,最新数据显示,我国每年新发病65.3万例,死亡率高达45.57/100,000。目前针对肺癌主要治疗方案是以手术、放疗、化疗和分子靶向治疗为基础的综合治疗。虽然近年来恶性肿瘤的治疗取得了很大的进步,但由于肺癌发病率高、治疗效果有限、去医院看病时已是中晚期肺癌患者,而且5年生存率非常低,往往不到20%。随着免疫学和肿瘤学的研究,宿主的免疫系统功能紧密相关与肿瘤的发生和进展,即使我们人体拥有免疫监视系统,但是仍然不能阻止恶性肿瘤的发病,癌细胞可通过某些机制躲过机体的免疫监视,在机体内生长、转移,给社会和家庭产生不良后果。趋化因子是一类小分子蛋白细胞因子家族成员中的一员,分子量大小为7-12k Da,具有能够诱导相关白细胞定向趋化移动的功能。大量研究证实,趋化因子受体CCR4在各种肿瘤如ATLL、乳腺癌、胃癌、头颈部癌中呈高表达,在肿瘤的发生发展中承担着重要角色。目前关于CCR4与非小细胞肺癌关系的报道较少。主要研究方法:1.利用免疫组织化学法分析78例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中CCR4的表达情况,综合分析NSCLC患者临床病例资料,探寻CCR4表达与非小细胞肺癌(NSCLC)临床病理特征之间的关系,运用流式细胞术和ELISA分析CCR4表达与非小细胞肺癌患者全身免疫状况和肿瘤组织免疫微环境的关系,初步探讨CCR4作为NSCLC预后标志和治疗靶点的可能性。2.利用ELISA和Realtime-PCR法检测肿瘤组织趋化因子CCL17和CCL22的表达,Transwell细胞趋化实验分析CCR4对肿瘤组织中Treg细胞的趋化作用,流式细胞术检测肿瘤组织培养上清诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+调节性T细胞的能力,并探究NSCLC患者调节性T细胞对自身效应性T细胞增殖的抑制作用及其调节机制。3.采用流式细胞术检测NSCLC病人肿瘤组织和癌旁组织中NK细胞表面表达的活化型受体(NKG2D、NKp30、NKp46)和抑制型受体(NKG2A)的受体表达谱情况,分析肿瘤组织NK细胞与CCR4表达和TGF-?1浓度的相关性,观察肿瘤组织培养上清是否影响NK细胞表型受体NKG2D的表达,流式细胞术检测CD69+NK细胞的表达以探究CD4+CD25+T细胞对NK细胞的活化调控及其机制,流式细胞术检测CD107?+NK细胞的表达以探究CD4+CD25+T细胞对NK细胞细胞毒作用的调控及其机制。实验结果与结论:1.在78例NSCLC肺癌组织标本中,CCR4的阳性表达率为57.7%;在癌旁组织标本中,阳性表达率为32.1%,统计分析显示非小细胞肺癌组织中CCR4的表达明显高于癌旁组织,差异有高度统计意义(P?<?0.01)。非小细胞肺癌组织中CCR4的阳性表达与NSCLC患者临床分期相关,而与患者的年龄、性别、组织学分型、病理分级、肿瘤大小、淋巴结状态均无关。NSCLC患者外周血NK细胞数量较正常对照组没有差异,CD8+细胞的数量和CD4+/CD8+比例较正常对照组存在差异,特别是Treg细胞和CCR4+Treg细胞的数量存在显著升高,这些细胞亚群的数量缺陷反映了肺癌患者的全身免疫功能状态。CCR4阳性NSCLC患者外周血细胞因子TGF-β1和IL-10浓度较正常对照组明显增高,差异有高度统计意义(P<0.01);而IL-2和IFN-γ浓度较正常对照组显著降低,差异有高度统计意义(P<0.01)。在CCR4阳性NSCLC患者肿瘤微环境中,NK细胞、Treg细胞、CCR4+Treg细胞的表达水平较癌旁组织存在显著差异,这些细胞亚群的数量改变可能与肺癌患者肿瘤组织免疫微环境的免疫功能状态有关。肿瘤组织中细胞因子TGF-β1和IL-10浓度较癌旁组织明显增高,差异有高度统计意义(P<0.01);而IL-2和IFN-γ浓度较癌旁组织显著降低,差异有高度统计意义(P<0.01)。肿瘤组织CCR4 m RNA较癌旁组织表达明显增高,差异有显著统计意义(P<0.01);肿瘤组织TGF-β1 m RNA表达较癌旁组织明显增高,差异有显著统计意义(P<0.01)。肿瘤组织中CCR4和TGF-β1的表达与Treg细胞水平呈明显正相关。将78例NSCLC患者分成CCR4阳性组和CCR4阴性组,采用Kaplan-Meier法分析NSCLC患者三年生存期的比较,随访结果显示CCR4阴性组患者较CCR4阳性组具有更长的生存期,差异有统计意义(P<0.05),提示非小细胞肺癌患者CCR4阴性表达可预示患者生存期的改善。2.免疫磁珠分选后的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞纯度均在90%以上,细胞获得率较高。肿瘤组织中趋化因子CCL17和CCL22的浓度较癌旁组织均明显增高,差异有高度统计意义(P<0.01)。在rh CCL17和rh CCL22的作用下,Transwell板下室的CD4+CD25+T细胞数量较空白对照组明显增多,差异有高度统计意义(P<0.01);CCR4中和抗体与rh CCL17/rh CCL22共同作用组,Transwell板下室的CD4+CD25+T细胞数量较rh CCL17或rh CCL22单独作用组明显降低,差异有高度统计意义(P<0.01),证明肿瘤组织中Treg细胞数量增多,可能与CCL17和CCL22的高浓度有关,通过趋化因子受体CCR4募集Treg细胞进入肿瘤组织。肿瘤组织Treg细胞数量的增多,还可能与肿瘤微环境中TGF-?1诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+调节性T细胞有关,中和性抗TGF-?1单克隆抗体能显著降低其诱导作用。肿瘤组织组和癌旁组织组调节性T细胞(CD4+CD25+T细胞)均能抑制效应性T细胞(CD4+CD25-T细胞)增值功能,而且肿瘤组织来源的Treg细胞抑制作用比癌旁组织组明显增强;随着Tregs:Teffs的比例由0:1、0.25:1、0.5:1向1:1增高,效应性T细胞(CD4+CD25-T细胞)的增殖指数逐渐降低,调节性T细胞对效应性T细胞的抑制率也呈现逐渐增大,证明调节性T细胞对效应性T细胞增值的抑制作用表现为浓度依耐性;当Tregs对Teffs比例相同条件下,肿瘤组织组调节性T细胞对效应性T细胞的抑制率强于癌旁组织组,差异有高度统计意义(P<0.001)。中和性抗TGF-?1单克隆抗体组Tregs对Teffs增值的抑制率较未加入组明显降低,差异有高度统计意义(P<0.01),证明Treg细胞可能通过TGF-?途径发挥其对Teff细胞增殖的抑制作用。3.肿瘤组织NK细胞较癌旁组织组低表达表面活化型受体NKG2D,差异有高度统计意义(P<0.01),其他活化型受体NKp30、NKp46及抑制型受体NKG2A较癌旁组织组无明显统计学差异(P>0.05),鉴于NKG2D是自然杀伤细胞的表面重要的活化性受体,在自然杀伤细胞发挥细胞毒作用时起关键因素,其表达下降可能会导致NK细胞没有足够量的活化型受体识别相应的配体,进一步导致NK细胞的活化程度不够,影响NK细胞在肿瘤微环境中的功能,进而介导了肿瘤的免疫逃逸。肿瘤组织中CCR4 m RNA与NK细胞的百分比呈显著负相关(P<0.01),该结果提示肿瘤组织中CCR4 m RNA高表达可负向调控了NK细胞的数量。以肺癌组织TGF-?1浓度与NK细胞数量进行线性相关性分析,结果显示肿瘤组织中TGF-?1浓度与NK细胞的百分比呈显著负相关(P<0.01),结果提示肿瘤组织中TGF-?1高浓度可能负向调控了NK细胞的数量。肿瘤组织培养上清混合培养基组NKG2D的表达较单纯1640培养基组显著下降,差异有显著统计意义(P<0.01);中和性抗TGF-?1单克隆抗体(20μg/ml)组NKG2D的表达较混合培养基组明显上升,差异有高度统计学意义(P<0.01),证明肿瘤微环境可通过TGF-?通路诱导NK细胞活化型受体NKG2D的下调,进而抑制NK细胞的免疫学功能。rh IL-2单独作用时肿瘤组织组NK细胞CD69+NK百分率较癌旁组织组降低,差异无统计意义(P>0.05),但较未刺激组明显升高,差异有高度统计意义(P<0.01);CD4+CD25+T细胞混合培养后,CD69+NK细胞百分率较rh IL-2单独作用组明显降低,差异有高度统计意义(P<0.01);使用中和性抗TGF-?1单克隆抗体可以减弱Treg对NK细胞活化的抑制作用,结果提示肿瘤组织中Treg细胞可能通过TGF-?通路调控NK细胞的活化。rh IL-2单独作用时,肿瘤组织组NK细胞对K562细胞的细胞毒作用较癌旁组织组明显降低,差异有高度统计意义(P<0.01);肿瘤组织Treg细胞混合培养均能明显降低两组NK细胞的细胞毒作用,差异有高度统计意义(P<0.01);加入中和性抗TGF-?1单克隆抗体可部分逆转Treg对NK细胞细胞毒作用的抑制作用,结果提示Treg细胞能通过TGF-?1信号通路抑制NK细胞细胞毒作用。