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论文一：衰老小鼠造血干细胞Keap1-Nrf2/ARE信号通路的变化
目前人口老龄化已经成为21世纪重要的社会问题之一。细胞是构成生物体结构、功能和发育的基本单位。因此，细胞衰老是机体衰老的基石，近年来科学家对细胞衰老进行了深入地研究，提出了多种细胞衰老机制学说，但迄今没有哪一种学说能诠释细胞衰老的本质。成体干细胞存在于多种成体组织器官，具有自我更新和多向分化的能力，它对损伤和衰老的组织细胞起着重要的修复作用，但是干细胞也会随增龄而逐渐衰老，这是老年性疾病发生与发展的重要基础。目前认为，机体衰老的最新学说是其自身干细胞的衰老。本课题组前期研究发现，随着小鼠年龄增加，其造血干细胞会发生衰老的生物学变化。在适当时间，采用某些方法干预衰老进程可以明显延缓造血干细胞的衰老。人参皂苷Rg1是“补气”要药人参的抗衰老成分，我们最新研究证明，它可拮抗氧化致衰剂所诱导的造血干细胞衰老，但其机制尚不清楚。最近发现，Keap1-Nrf2/ARE是机体抵抗氧化应激的防御性信号通路，该通路阻滞将导致干细胞衰老，重新激活Nrf2通路能够有效逆转早老症患者干细胞的衰老进程。通过查阅文献，我们提出研究假说:造血干细胞随增龄发生的氧化应激性衰老可能与NRF2信号通路有密切关系。本文将通过构建衰老小鼠模型和建立造血干细胞体外衰老模型，进行上述假说的验证，旨在为阐释造血干细胞衰老的新机制奠定理论基础，为寻找延缓造血干细胞衰老的途径提供实验依据。
方法：
1.小鼠造血干细胞(Sca-1+HSCs)的分离与鉴定：脱颈椎处死小鼠，无菌操作取小鼠股骨、胫骨，分离出骨髓单个核细胞(BMMCs)，免疫磁珠分选法(MACS)分离、纯化骨髓中的Sca-1+HSCs,流式细胞术鉴定细胞纯度。
2.造血干细胞体外衰老模型构建与指标检测:将分离纯化后的Sca-1+HSCs分为两组：正常对照组(常规培养)和D-gal致衰组(D-gal半乳糖(D-gal，166mmol/L,48h))。分别进行如下检测：CCK-8法检测增殖能力；SA-β-Gal染色检测细胞衰老情况；ELISA试剂盒检测SOD、CAT、MDA和GSH-Px的含量；q-PCR检测Keap-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)mRNA的表达水平。
3.造血干细胞体内衰老模型构建与指标检测:6-8周龄C57BL/6J小鼠随机分为两组：D-gal致衰组：小鼠腹腔注射D-gal(120mg/kg)，qd×42d；正常对照组：腹腔注射等时与等量的生理盐水。建模成功后第2天，收集小鼠全血及血清，外周全血血常规检测小鼠的造血功能；ELISA试剂盒检测血清SOD、CAT、MDA和GSH-Px的含量；分离纯化两组小鼠骨髓Sca-1+HSCs，q-PCR检测细胞中Keap-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)mRNA的表达水平。
结果：
1．流式细胞术检测分选后Sca-1+HSCs纯度为85.97±5.99%。提示，免疫磁珠分选得到的Sca-1+HSCs具有较高的纯度。
2.Sca-1+HSCs在体外经D-gal诱导衰老后，细胞增殖能力明显降低；SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加；SOD、CAT和GSH-Px的含量均减少，MDA含量增加；Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)的mRNA表达水平显著降低。
3.Sca-1+HSCs在体内经D-gal诱导衰老后，外周血血细胞计数无明显变化；血清中SOD、CAT和GSH-Px的含量均减少，MDA含量增加；Sca-1+HSCs中Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)的mRNA表达水平显著降低。
结论：
1.氧化致衰剂D-gal可以构建Sca-1+HSCs体外衰老模型。
2.氧化致衰剂D-gal可以构建Sca-1+HSCs体内衰老模型。
3.Sca-1+HSCs衰老与氧化应激水平升高有关，可能机制与降低Keap-Nrf2/ARE信号通路相关基因表达水平有关。
论文二：人参皂苷Rg1对衰老小鼠胃肠道结构的保护作用及初步机制
衰老(Aging)是生物体发育成熟后，随着年龄增加体内器官、组织和细胞逐步地发生不可逆转的、全面的结构和功能衰退，伴随此进程不断推移和发展，机体的死亡将不可避免地发生。自然衰老本身并不是疾病，但它与许多老年性疾病紧密相联，随着年龄增长，人体多种脏器的组织结构与生理功能逐渐衰退，机体的抗病能力和修复损伤能力也随之下降，老年性疾病发生不可避免。延缓衰老尤其是避免病理性老化是现代医学追求的目标。随着人口老龄化进程的加快和人口寿命的延长，加快推动衰老机制与老年性疾病的相关研究有重要科学意义及社会价值。
人参中含有多种活性成分，包括人参皂苷，脂肪酸，多糖和矿物油，人参皂苷是其主要药用成分，其中人参皂苷Rg1是人参皂苷最具活性主要成分。课题组前期研究发现，人参皂苷Rg1作为人参中重要的抗衰老成分，具有“双向调节”和“扶正祛邪”作用，即对机能低下、损伤和衰老的细胞有促进增殖分化和激活其功能的作用，对恶性肿瘤细胞等有抑制增殖促凋亡的作用。
课题组最新研究表明，人参皂苷Rg1具有延缓造血干细胞和间充质干细胞等多种干细胞衰老的作用，其相关机制已具体阐述。我们推测人参皂苷Rg1能延缓器官衰老和拮抗致衰剂对器官的损伤作用。消化系统退行性改变与功能低下是机体衰老的重要生物学特点之一。随年龄增加老年机体的消化吸收能力逐渐下降，因此保护好消化系统的结构与功能对延缓机体衰老极为重要。本文使用氧化致衰剂D-半乳糖(D-gal)建立小鼠衰老模型，研究人参皂苷Rg1对衰老小鼠消化管的保护作用和初步机制，旨在为人参皂苷Rg1防治老年性疾病提供理论与实验室依据。
方法
小鼠衰老模型建立:C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、Rg1对照组、D-gal致衰组和Rg1干预组。D-gal致衰组：小鼠腹腔注射D-gal(120mg/kg)，qd×42d；Rg1干预组：腹腔注射D-gal剂量与时间同D-gal致衰组，第15天起腹腔注射Rg1(40mg/kg)，qd×28d；正常对照组：腹腔注射生理盐水(10mL/kg)，qd×42d；Rg1对照组：注射生理盐水(10mL/kg)，时间同正常对照组，第15天起腹腔注射Rg1(40mg/kg)，qd×28d。药物注射完成后第2天，取胃肠道进行相关指标检测：
1.胃肠道脏器指数的测定；
2.胃肠道组织病理学及其超微结构观察；
3.β-半乳糖苷酶染色检测胃肠道衰老情况；
4.胃肠道组织氧化损伤指标的检测；
5.胃肠道组织中Keap1-Nrf2/ARE相关蛋白的检测。
结果
1.D-gal致衰组小鼠逐步呈现出毛色晦暗，皮肤弹性差，精神萎靡，倦怠嗜睡，进食量和活动明显减少，体质量增加缓慢的特征，其衰老生物学表现与自然衰老体征相似，其它三组小鼠无明显衰老表现。
2.D-gal致衰组小鼠的小肠脏器指数增加，使用Rg1干预后，小鼠的胃与小肠脏器指数均有所降低。
3.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织结构损伤明显，线粒体肿胀，核膜溶解，粗面内质网扩张。使用Rg1干预后，胃肠道组织结构有所改善。
4.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织SA-β-gal染色光密度增加，提示器官有明显衰老表现。使用Rg1干预后，小鼠胃肠道组织衰老情况有所缓解。
5.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织中，SOD和CAT含量降低，MDA含量升高。使用Rg1干预后，小鼠胃肠道组织中，SOD和CAT含量升高，MDA含量降低，提示Rg1增强小鼠胃肠道组织抗氧化能力。
6.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织中，HO-1和Nrf2蛋白表达量降低，Keap1蛋白表达量升高。使用Rg1干预后，HO-1和Nrf2蛋白表达量升高，Keap1蛋白表达量降低。
结论
1.注射D-gal可成功复制小鼠衰老模型，生物学行为与自然衰老小鼠一致。
2.Rg1可延缓D-gal所致小鼠衰老，缓解衰老小鼠的氧化应激状态，改善小鼠胃肠道组织结构的变化。
3.Rg1拮抗D-gal所致衰老小鼠胃肠道结构的变化可能与其调控Keap1-Nrf2/ARE通路拮抗氧化应激反应有关。
论文三：当归多糖对人白血病干细胞增殖分化与体内移植的影响
目的：探讨当归多糖(ASP)对人白血病干细胞(LSCs)增殖分化及体内移植的影响。方法：免疫磁性分选正常人和髓系白血病患者骨髓中CD34+CD38-细胞，分为正常CD34+CD38-对照组、CD34+CD38-LSCs对照组、正常CD34+CD38-ASP组和CD34+CD38-LSCsASP组，后两组在常规培养基础上加入ASP(终浓度40μg/ml)。流式细胞术检测CD34+CD38-细胞纯度；台盼蓝染色检测细胞活性；CCK-8和CFU-Mix检测CD34+CD38-LSCs增殖分化能力；RT-PCR检测衰老相关基因表达水平。体内移植LSCs建立CD34+CD38-LSCs小鼠移植模型，随机分为ASP移植模型组(腹腔注射ASP，200mg/kg，qd×14d)和移植模型组(注射等时与等量的生理盐水)。药物注射完成第2d，计数白细胞总数和分类计数，观察血细胞形态；免疫荧光细胞化学法检测受体鼠骨髓中CD34+CD38-LSCs；衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察骨髓有核细胞(BMMCs )染色阳性百分率；流式细胞术检测小鼠BMMCs细胞周期分布；CFU-Mix检测小鼠BMMCs集落形成能力。
结果：分选后CD34+CD38-细胞纯度达到91.14±1.02%，细胞活性为95.42±3.5%；CD34+CD38-LSCs对照组细胞增殖与集落形成能力显著高于正常CD34+CD38-对照组；CD34+CD38-LSCsASP组细胞增殖能力与集落形成能力明显低于CD34+CD38-LSCs对照组；CD34+CD38-LSCsASP组细胞表达p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1基因水平升高。移植CD34+CD38-LSCs后小鼠骨髓中存在人源性LSCs。移植模型组小鼠白细胞总数增加，中性粒细胞比例升高，淋巴细胞比例降低；注射ASP可明显降低白细胞总数和中性粒细胞比例，淋巴细胞比例有所升高；处于G0/G1期中的BMMCs数量增加，S期细胞数量减少；SA-β-Gal染色阳性细胞率明显提高；CFU-Mix集落形成数减少。结论：ASP在体内与体外均能抑制CD34+CD38-LSCs增殖分化，其机制可能与调节细胞衰老相关基因表达密切相关。
目前人口老龄化已经成为21世纪重要的社会问题之一。细胞是构成生物体结构、功能和发育的基本单位。因此，细胞衰老是机体衰老的基石，近年来科学家对细胞衰老进行了深入地研究，提出了多种细胞衰老机制学说，但迄今没有哪一种学说能诠释细胞衰老的本质。成体干细胞存在于多种成体组织器官，具有自我更新和多向分化的能力，它对损伤和衰老的组织细胞起着重要的修复作用，但是干细胞也会随增龄而逐渐衰老，这是老年性疾病发生与发展的重要基础。目前认为，机体衰老的最新学说是其自身干细胞的衰老。本课题组前期研究发现，随着小鼠年龄增加，其造血干细胞会发生衰老的生物学变化。在适当时间，采用某些方法干预衰老进程可以明显延缓造血干细胞的衰老。人参皂苷Rg1是“补气”要药人参的抗衰老成分，我们最新研究证明，它可拮抗氧化致衰剂所诱导的造血干细胞衰老，但其机制尚不清楚。最近发现，Keap1-Nrf2/ARE是机体抵抗氧化应激的防御性信号通路，该通路阻滞将导致干细胞衰老，重新激活Nrf2通路能够有效逆转早老症患者干细胞的衰老进程。通过查阅文献，我们提出研究假说:造血干细胞随增龄发生的氧化应激性衰老可能与NRF2信号通路有密切关系。本文将通过构建衰老小鼠模型和建立造血干细胞体外衰老模型，进行上述假说的验证，旨在为阐释造血干细胞衰老的新机制奠定理论基础，为寻找延缓造血干细胞衰老的途径提供实验依据。
方法：
1.小鼠造血干细胞(Sca-1+HSCs)的分离与鉴定：脱颈椎处死小鼠，无菌操作取小鼠股骨、胫骨，分离出骨髓单个核细胞(BMMCs)，免疫磁珠分选法(MACS)分离、纯化骨髓中的Sca-1+HSCs,流式细胞术鉴定细胞纯度。
2.造血干细胞体外衰老模型构建与指标检测:将分离纯化后的Sca-1+HSCs分为两组：正常对照组(常规培养)和D-gal致衰组(D-gal半乳糖(D-gal，166mmol/L,48h))。分别进行如下检测：CCK-8法检测增殖能力；SA-β-Gal染色检测细胞衰老情况；ELISA试剂盒检测SOD、CAT、MDA和GSH-Px的含量；q-PCR检测Keap-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)mRNA的表达水平。
3.造血干细胞体内衰老模型构建与指标检测:6-8周龄C57BL/6J小鼠随机分为两组：D-gal致衰组：小鼠腹腔注射D-gal(120mg/kg)，qd×42d；正常对照组：腹腔注射等时与等量的生理盐水。建模成功后第2天，收集小鼠全血及血清，外周全血血常规检测小鼠的造血功能；ELISA试剂盒检测血清SOD、CAT、MDA和GSH-Px的含量；分离纯化两组小鼠骨髓Sca-1+HSCs，q-PCR检测细胞中Keap-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)mRNA的表达水平。
结果：
1．流式细胞术检测分选后Sca-1+HSCs纯度为85.97±5.99%。提示，免疫磁珠分选得到的Sca-1+HSCs具有较高的纯度。
2.Sca-1+HSCs在体外经D-gal诱导衰老后，细胞增殖能力明显降低；SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加；SOD、CAT和GSH-Px的含量均减少，MDA含量增加；Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)的mRNA表达水平显著降低。
3.Sca-1+HSCs在体内经D-gal诱导衰老后，外周血血细胞计数无明显变化；血清中SOD、CAT和GSH-Px的含量均减少，MDA含量增加；Sca-1+HSCs中Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关基因(GCLC、GSR、GSTM1和GCLM)的mRNA表达水平显著降低。
结论：
1.氧化致衰剂D-gal可以构建Sca-1+HSCs体外衰老模型。
2.氧化致衰剂D-gal可以构建Sca-1+HSCs体内衰老模型。
3.Sca-1+HSCs衰老与氧化应激水平升高有关，可能机制与降低Keap-Nrf2/ARE信号通路相关基因表达水平有关。
论文二：人参皂苷Rg1对衰老小鼠胃肠道结构的保护作用及初步机制
衰老(Aging)是生物体发育成熟后，随着年龄增加体内器官、组织和细胞逐步地发生不可逆转的、全面的结构和功能衰退，伴随此进程不断推移和发展，机体的死亡将不可避免地发生。自然衰老本身并不是疾病，但它与许多老年性疾病紧密相联，随着年龄增长，人体多种脏器的组织结构与生理功能逐渐衰退，机体的抗病能力和修复损伤能力也随之下降，老年性疾病发生不可避免。延缓衰老尤其是避免病理性老化是现代医学追求的目标。随着人口老龄化进程的加快和人口寿命的延长，加快推动衰老机制与老年性疾病的相关研究有重要科学意义及社会价值。
人参中含有多种活性成分，包括人参皂苷，脂肪酸，多糖和矿物油，人参皂苷是其主要药用成分，其中人参皂苷Rg1是人参皂苷最具活性主要成分。课题组前期研究发现，人参皂苷Rg1作为人参中重要的抗衰老成分，具有“双向调节”和“扶正祛邪”作用，即对机能低下、损伤和衰老的细胞有促进增殖分化和激活其功能的作用，对恶性肿瘤细胞等有抑制增殖促凋亡的作用。
课题组最新研究表明，人参皂苷Rg1具有延缓造血干细胞和间充质干细胞等多种干细胞衰老的作用，其相关机制已具体阐述。我们推测人参皂苷Rg1能延缓器官衰老和拮抗致衰剂对器官的损伤作用。消化系统退行性改变与功能低下是机体衰老的重要生物学特点之一。随年龄增加老年机体的消化吸收能力逐渐下降，因此保护好消化系统的结构与功能对延缓机体衰老极为重要。本文使用氧化致衰剂D-半乳糖(D-gal)建立小鼠衰老模型，研究人参皂苷Rg1对衰老小鼠消化管的保护作用和初步机制，旨在为人参皂苷Rg1防治老年性疾病提供理论与实验室依据。
方法
小鼠衰老模型建立:C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、Rg1对照组、D-gal致衰组和Rg1干预组。D-gal致衰组：小鼠腹腔注射D-gal(120mg/kg)，qd×42d；Rg1干预组：腹腔注射D-gal剂量与时间同D-gal致衰组，第15天起腹腔注射Rg1(40mg/kg)，qd×28d；正常对照组：腹腔注射生理盐水(10mL/kg)，qd×42d；Rg1对照组：注射生理盐水(10mL/kg)，时间同正常对照组，第15天起腹腔注射Rg1(40mg/kg)，qd×28d。药物注射完成后第2天，取胃肠道进行相关指标检测：
1.胃肠道脏器指数的测定；
2.胃肠道组织病理学及其超微结构观察；
3.β-半乳糖苷酶染色检测胃肠道衰老情况；
4.胃肠道组织氧化损伤指标的检测；
5.胃肠道组织中Keap1-Nrf2/ARE相关蛋白的检测。
结果
1.D-gal致衰组小鼠逐步呈现出毛色晦暗，皮肤弹性差，精神萎靡，倦怠嗜睡，进食量和活动明显减少，体质量增加缓慢的特征，其衰老生物学表现与自然衰老体征相似，其它三组小鼠无明显衰老表现。
2.D-gal致衰组小鼠的小肠脏器指数增加，使用Rg1干预后，小鼠的胃与小肠脏器指数均有所降低。
3.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织结构损伤明显，线粒体肿胀，核膜溶解，粗面内质网扩张。使用Rg1干预后，胃肠道组织结构有所改善。
4.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织SA-β-gal染色光密度增加，提示器官有明显衰老表现。使用Rg1干预后，小鼠胃肠道组织衰老情况有所缓解。
5.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织中，SOD和CAT含量降低，MDA含量升高。使用Rg1干预后，小鼠胃肠道组织中，SOD和CAT含量升高，MDA含量降低，提示Rg1增强小鼠胃肠道组织抗氧化能力。
6.D-gal致衰组小鼠胃肠道组织中，HO-1和Nrf2蛋白表达量降低，Keap1蛋白表达量升高。使用Rg1干预后，HO-1和Nrf2蛋白表达量升高，Keap1蛋白表达量降低。
结论
1.注射D-gal可成功复制小鼠衰老模型，生物学行为与自然衰老小鼠一致。
2.Rg1可延缓D-gal所致小鼠衰老，缓解衰老小鼠的氧化应激状态，改善小鼠胃肠道组织结构的变化。
3.Rg1拮抗D-gal所致衰老小鼠胃肠道结构的变化可能与其调控Keap1-Nrf2/ARE通路拮抗氧化应激反应有关。
论文三：当归多糖对人白血病干细胞增殖分化与体内移植的影响
目的：探讨当归多糖(ASP)对人白血病干细胞(LSCs)增殖分化及体内移植的影响。方法：免疫磁性分选正常人和髓系白血病患者骨髓中CD34+CD38-细胞，分为正常CD34+CD38-对照组、CD34+CD38-LSCs对照组、正常CD34+CD38-ASP组和CD34+CD38-LSCsASP组，后两组在常规培养基础上加入ASP(终浓度40μg/ml)。流式细胞术检测CD34+CD38-细胞纯度；台盼蓝染色检测细胞活性；CCK-8和CFU-Mix检测CD34+CD38-LSCs增殖分化能力；RT-PCR检测衰老相关基因表达水平。体内移植LSCs建立CD34+CD38-LSCs小鼠移植模型，随机分为ASP移植模型组(腹腔注射ASP，200mg/kg，qd×14d)和移植模型组(注射等时与等量的生理盐水)。药物注射完成第2d，计数白细胞总数和分类计数，观察血细胞形态；免疫荧光细胞化学法检测受体鼠骨髓中CD34+CD38-LSCs；衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察骨髓有核细胞(BMMCs )染色阳性百分率；流式细胞术检测小鼠BMMCs细胞周期分布；CFU-Mix检测小鼠BMMCs集落形成能力。
结果：分选后CD34+CD38-细胞纯度达到91.14±1.02%，细胞活性为95.42±3.5%；CD34+CD38-LSCs对照组细胞增殖与集落形成能力显著高于正常CD34+CD38-对照组；CD34+CD38-LSCsASP组细胞增殖能力与集落形成能力明显低于CD34+CD38-LSCs对照组；CD34+CD38-LSCsASP组细胞表达p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1基因水平升高。移植CD34+CD38-LSCs后小鼠骨髓中存在人源性LSCs。移植模型组小鼠白细胞总数增加，中性粒细胞比例升高，淋巴细胞比例降低；注射ASP可明显降低白细胞总数和中性粒细胞比例，淋巴细胞比例有所升高；处于G0/G1期中的BMMCs数量增加，S期细胞数量减少；SA-β-Gal染色阳性细胞率明显提高；CFU-Mix集落形成数减少。结论：ASP在体内与体外均能抑制CD34+CD38-LSCs增殖分化，其机制可能与调节细胞衰老相关基因表达密切相关。