缺血性视网膜病变中,由于视网膜缺血缺氧,既可诱发视网膜新生血管的形成,又可导致谷氨酸大量释放,促使神经元细胞死亡。在缺血性疾病中,“神经血管单元”的概念强调神经细胞、内皮细胞和神经胶质细胞在疾病的神经与血管修复过程中均起到至关重要的作用。内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,具有高度增殖的潜力及血管内皮的特性,能够聚集到不同的缺血组织中促进血管内皮的修复,具有保护血管内皮功能的重要作用。小胶质细胞在不同的条件下呈现不同的活化状态,经不同刺激因素活化后可表现为促炎型M1和抗炎型M2。缺血性视网膜病变中神经细胞的凋亡增多,小胶质细胞通过在低氧条件下使神经细胞表达和释放细胞因子参与视网膜神经细胞死亡调控。基于此,本研究将EPCs注射到氧诱导视网膜病变小鼠模型的玻璃体腔内,观察其对视网膜血管的作用,并体外培养小鼠视网膜神经元并使用海人藻酸(KA)(谷氨酸结构类似物)诱导建立兴奋毒性神经元损伤的体外模型,与不同激活状态的小胶质细胞共培养,观察小胶质细胞对损伤后的神经元的作用,为缺血性视网膜病变的细胞治疗及免疫治疗提供新的思路。目的:探讨缺血性视网膜病变中玻璃体腔移植的EPCs对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)视网膜血管损伤的治疗作用及激活的不同亚型小胶质细胞对KA介导的视网膜神经元兴奋毒性损伤的免疫调控机制。方法:(1)用60%Percoll分离液密度梯度离心的方法分离人脐带血中EPCs,用5μmol/L羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记EPCs。应用混合气体(75%氧气:25%氮气)制作C57BL/6J小鼠OIR模型。实验分组:正常对照组(NC组)24眼、高氧组(OIR组)48眼、EPCs组30眼和磷酸盐缓冲液组(PBS组)18眼,其中EPCs组和PBS组分别与OIR小鼠玻璃体腔内注射CFSE标记EPCs或PBS。分时段处死各组小鼠,行视网膜石蜡切片、冰冻切片、视网膜铺片ADP酶染色、伊文思蓝心腔灌注视网膜铺片等检查,比较EPCs移植前后视网膜新生血管消退情况及示踪EPCs。(2)取胚胎16-18天(d)胎鼠视网膜行视网膜混合神经元原代培养,并应用KA诱导建立视网膜神经元毒性损伤模型,CCK8检测评估视网膜神经元活性的损伤程度。取生后0-2d(P0-2)新生小鼠大脑皮质行混合胶质细胞原代培养,利用免疫磁珠技术分选出小胶质细胞,并加入不同组合的细胞因子使其诱导分化为激活状态,ELISA法测定M0/M1/M2分泌的各种细胞因子浓度。建立视网膜神经元与各亚型小胶质细胞体外共培养模型,通过CCK8检测评估共培养的小胶质细胞对视网膜神经元活性的影响及损伤程度,并加入KA刺激,通过CCK8检测评估不同亚型小胶质细胞M0/M1/M2与视网膜神经元共培养对KA致神经元毒性损伤的影响,并通过ELISA测定不同共培养组别分泌细胞因子的浓度变化。结果:(1)通过视网膜铺片ADP酶染色观察,OIR组和PBS组小鼠视网膜血管扩张、迂曲,甚至闭塞并形成无灌注区,出现部分新生血管丛。EPCs组在注射后1周(w)视网膜缺氧表现较同时间段PBS组及OIR组有所减轻,显示较少的无灌注区域和新生血管簇。(2)在P19,组织病理学观察NC组视网膜内丛状层和内界膜之间的细胞均为神经节细胞,呈单层分布,其细胞核呈圆形且大。OIR组和PBS组视网膜可见内丛状层和内界膜之间的细胞数量显著增加,其中大部分是非神经节细胞,细胞核呈现各种形态,有一些新生血管细胞核,且这些细胞的分布是完全无序的,许多新生血管细胞核突破内界膜。EPCs组视网膜非神经节细胞较少,罕有突破内界膜的新生血管细胞核,内丛状层与内界膜之间视网膜细胞呈现相对整齐的排列,突破内界膜的血管内皮细胞核数量较PBS组明显减少(P<0.05,n=6)。(3)移植后视网膜冰冻切片显示,CFSE标记EPCs移植后3d可见玻璃体大量荧光细胞,1w可见EPCs存在于内丛状层和内界膜之间。伊文思蓝视网膜铺片法观察EPCs组在注射后3d可见大量CFSE标记的EPCs位于玻璃体及粘附于视网膜表面,1w可见EPCs出现在视网膜血管中。(4)KA可对原代培养的视网膜神经元造成兴奋性毒性损伤,部分视网膜神经元出现轴突断裂、损伤甚至死亡,神经元活性CCK8检测结果为54.6%±2.0%。以LPS和IFNγ联合刺激可诱导小胶质细胞向M1型分化,可分泌TNF-α、IFN-γ和IL-6。IL-4、IL-10和TGF-β联合刺激可诱导小胶质细胞向M2型分化,可分泌IL-4和IL-10。(5)建立视网膜神经元与分化后的小胶质细胞体外共培养模型。M1与视网膜神经元共培养使部分视网膜神经元死亡、轴突断裂,神经元活性仅为40.52%±4.84%;而与M2型小胶质细胞共培养的神经元活性无明显影响,为99.12%±0.86%。两组间比较有显著性差异(P<0.01,n=3)。与M1共培养的神经元在加入KA刺激后神经元损伤加重,活性为21.48%±1.70%;而与M2型小胶质细胞共培养的神经元在加入KA刺激后仅有轻度轴突损伤、少许细胞死亡,活性为90.26%±4.19%。两组间比较有显著性差异(P<0.01,n=3)。(6)KA刺激或未刺激情况下,与M1共培养的神经元相比,M0共培养的神经元和M2共培养的神经元分泌IL-6显著减少(P<0.05,n=3);加入KA与不加入KA比较,M0共培养的神经元和M1共培养的神经元分泌IL-6明显增加(分别为P<0.001,n=3;P<0.05,n=3)。加入KA或不加入KA的情况下,神经元分泌IL-10无明显变化(P>0.05,n=3);在不加入KA的共培养模型中,与单纯培养神经元相比,M1共培养的神经元分泌IL-10显著减少(P<0.001,n=3);加入KA的共培养模型中,与单纯培养神经元或M0共培养的神经元相比,M1共培养的神经元和M2共培养的神经元分泌IL-10浓度均显著降低,差异具有统计学意义。结论:(1)人脐血分离出的EPCs经玻璃体腔注射移植到OIR小鼠体内可对OIR病变的回退起到一定的促进作用。(2)诱导分化后的M2型小胶质细胞可在体外保护视网膜神经元免受KA介导的神经兴奋毒性作用。(3)缺血性视网膜病变中的“神经血管单元”,即内皮细胞、神经元和神经胶质细胞,在血管修复和神经修复中起重要作用。