对于哺乳动物来说,味觉是极为重要的,它能调节哺乳动物的摄食行为,感知外界的各种刺激,从而对有害的刺激迅速作出反应,对美好的味觉刺激感到愉悦,这些味觉感受都来自于味觉细胞的功能。味觉细胞的微绒毛上存在多种味觉受体蛋白,这些受体蛋白包括T1R1、T1R2和T1R3,统称为T1Rs家族受体蛋白。T1R1、T1R2和T1R3是G蛋白耦联受体,它们两两之间以异源二聚体的形式发挥其生物功能,其中,T1R3受体蛋白是一种伴侣蛋白,它与T1R1结合可形成鲜味受体,与T1R2结合可形成甜味受体蛋白。大量研究显示这些味觉受体除了在味觉组织中有大量表达,它们在很多非味觉组织中同样发挥着不可取代的作用,如在胃中可协助营养物质的识别和应答,在胰腺中可刺激激素的释放。为进一步研究T1Rs家族受体蛋白的生物功能,需要获得大量适合生化或结构研究的纯化受体蛋白,但国内外对其制备方法的研究较少,这是由于受体蛋白在其天然脂膜的疏水环境外可能无法维持其正常的三维结构,且T1Rs家族蛋白在表达中易降解,因此研究困难。本研究致力于建立一种能够获得大量T1Rs家族受体蛋白的制备方法,为进一步研究T1Rs家族蛋白的功能及其作用机制提供物质基础。本论文主要在大肠杆菌表达系统和哺乳动物表达系统中表达T1Rs家族受体蛋白,而对于大肠杆菌表达系统的研究中,也进行了一系列的复性方法的研究,主要研究了直接透析法、纯化透析法和纯化滴入法复性T1Rs家族受体蛋白,采用拉曼光谱验证纯化滴入法复性后的受体蛋白是否正确进行了正确的折叠,运用荧光光谱法检测复性后的受体蛋白是否可以对不同的味道进行识别,具体的研究内容和结果如下:1.T1Rs家族受体蛋白表达体系的构建、选择和优化为表达T1Rs家族受体蛋白,分别构建了哺乳动物表达体系和大肠杆菌表达体系,哺乳动物表达体系选择PcDNA3.1 His B为表达载体,293 T为表达细胞,转染后在培养箱中培养24h,表达结果显示未成功表达出T1Rs家族受体蛋白。大肠杆菌表达体系选择Pet-28a为表达载体,BL21为表达细胞,表达结果显示T1Rs家族受体蛋白形成了包涵体,不能通过超声破碎释放到上清中,而是留在了细胞沉淀中,需要通过复性,才能使受体蛋白重新折叠,恢复其正确的空间结构。2.T1Rs家族受体蛋白的复性研究表达后的包涵体蛋白首先使用超声破碎仪进行洗涤去除杂蛋白,再用盐酸胍或者尿素等变性剂改变包涵体蛋白的空间结构使其溶于变性剂中,随后溶解的蛋白采用不同的方法进行复性。本研究考察了三种复性方法,包括直接透析法、纯化透析法和纯化滴入法,直接透析法用变性后的蛋白溶液直接缓慢稀释复性,并采用超滤进行浓缩;纯化透析复性法将变性蛋白置于透析缓冲液中透析复性,并采用脱盐柱进行脱盐和浓缩;纯化滴入法将变性蛋白与镍柱结合,洗脱,纯化后在结合缓冲液中复性,最后,透析除盐后真空冻干浓缩。结果表明:直接透析复性法采用的超声洗涤除去杂蛋白效果不好,复性以及浓缩过程中,蛋白易降解,最后所得的可溶性蛋白几乎全降解;纯化透析法步骤较为简单,也可成功制备大量可溶性T1Rs家族受体蛋白,但成本较高;纯化滴入法采用镍柱除杂蛋白,效果较好,变性以及冻干浓缩的损失较小,最后可得到大量的可溶性T1Rs家族受体蛋白,相较于直接透析法步骤更加简单方便,成本更低。通过拉曼光谱分析得出了纯化滴入法复性后的受体蛋白的二级结构组成含量,表明复性后的受体蛋白进行了正确折叠。荧光光谱检测纯化滴入法复性的受体蛋白与配体结合后的荧光强度均显著降低,表明复性后的蛋白可识别不同的味道。