论文部分内容阅读
目的： 构建人3型腺病毒六邻体高变区HVR1,HVR2,HVR5,HVR7上多组不同的氨基酸修饰嵌合重组体，探讨六邻体高变区的氨基酸修饰限制，据此应用到六邻体HVR1和HVR2同时嵌合表达乙肝病毒表面抗原preS1上两个中和抗原表位的人3型重组腺病毒，验证是否影响所展示表位的抗原特性。 方法： 通过对人3型腺病毒六邻体的同源建模以及与4型和7型的氨基酸序列比对分析，设计多组嵌合外源表位到六邻体高变区HVR1,HVR2,HVR5,HVR7上不同位置的重组腺病毒。以overlap PCR技术扩增出各突变六邻体，酶切后克隆至穿梭质粒pBR322-L/R，重组穿梭质粒pBR322-L/R-mHexon与骨架质粒pBRAdΔE3GFP分别酶切后在E.coli BJ5183中同源重组，将PCR、酶切和测序鉴定均正确的重组质粒pBRAdΔE3GFP-mHexon经AsiS I线性化后转染AD293细胞，根据能否成功拯救出病毒来判断六邻体高变区的氨基酸修饰限制。而后据此设计六邻体HVR1和HVR2同时嵌合表达乙肝病毒表面抗原preS1上两个中和抗原表位的引物，应用同样的方法构建重组腺病毒质粒pBRAdΔE3GFP-preS1，转染AD293细胞拯救病毒。同时利用原核表达载体pGEX-4T3表达GST融合蛋白 GST-preS1，将重组腺病毒 AD3E-preS1和融合蛋白 GST-preS1分别免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠获得多抗血清。通过ELISA，Western blot实验检测六邻体嵌合表达外源表位的抗原特性。 结果： 通过构建多组重组腺病毒质粒的拯救实验，仅有MH1、MH1-6、MH2、MH2-3、MH5、MH5-2、MH7、MH7-2、MH7-3和MH7-4被成功拯救，MH1-2、MH1-3、MH1-4、MH1-5和MH2-2未能成功包装出病毒颗粒，并且外源表位嵌入六邻体后不影响腺病毒的稳定性和生长繁殖特性。据此构建的六邻体HVR1和HVR2同时嵌合表达乙肝病毒表面抗原preS1上两个中和抗原表位的重组腺病毒质粒pBRAdΔE3GFP-preS1可以成功包装出病毒颗粒。嵌合到六邻体HVR1和HVR2的表位KR359和KR127亦成功展示在重组腺病毒颗粒表面，诱导产生的小鼠多抗血清能识别 GST融合表达抗原以及天然的乙肝病毒表面抗原，证明乙肝病毒表面抗原preS1表位KR359和KR127的免疫原性并无改变。 结论： 人3型腺病毒六邻体高变区HVR1,HVR2,HVR5,HVR7氨基酸在替换为外源表位时不能被全部删除，其中六邻体高变区的 HVR1中136IVTT139以及148TTNT151，HVR2的164KEGLQIGKDI174以及181KPIYADK187，HVR5的265DGR267以及276 PEIVLYTEN284，HVR7的422IKVKTD427以及432WEKDAN437相对较保守，在被替换后可能影响六邻体的正常折叠导致病毒拯救不成功。后续构建重组腺病毒质粒pBRAdΔE3GFP-preS1同时在六邻体HVR1和HVR2嵌合表位KR359和KR127亦能证实上述结论。并且在六邻体高变区同时嵌合多个外源中和表位时不影响表位自身的免疫原性，为将来多价抗原疫苗研究应用提供基础。