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热激蛋白(heat shock proteins,Hsp)是一类受胁迫而诱导大量表达的蛋白质,普遍存在于植物和动物细胞中。作为分子伴侣的核心成分,Hsp在生长发育过程中负责蛋白质的折叠、组装、转运和降解,在维持细胞稳态中发挥重要作用。近年来,Hsp70被发现广泛参与到病毒的侵入、解聚、复制、运动、基因表达和病毒粒子形成等过程中,但Hsp70与病毒不同组分的互作如何协同调控病毒的复制循环仍有待深入研究。小热激蛋白(sHsp)参与病毒侵染的报道较少,多见于动物病毒的研究,sHsp如何调控植物病毒侵染及其分子机制仍不清楚。基于此,本研究以甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus,BBSV)为材料,对CP、p23和Hsc70-2三者的互作关系及其如何调控病毒侵染进行了较深入地探索,并对Hsp17.6在BBSV侵染中的功能进行了初步分析。本实验室前期的研究发现,Hsc70-2存在于BBSV外壳蛋白(coat protein,CP)和复制辅助蛋白p23的免疫共沉淀复合物中,在此基础上,本研究首先克隆了本生烟(Nicotiana benthamiana)Hsc70-2基因,利用pull-down、双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)和萤火虫荧光素酶互补成像(LCI)等实验技术,证明Hsc70-2分别与CP和p23直接互作,而CP和p23之间不存在相互作用,且三者不能通过Hsc70-2形成复合体。Hsc70-2与CP互作发生在细胞质中且形成较大的聚集体,Hsc70-2与p23互作发生在内质网衍生的聚集体中。Pull-down和BiFC结果表明,CP和p23都结合Hsc70-2的核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain,NBD)。BBSV侵染温和地诱导Hsc70-2表达上调,超表达Hsc70-2促进BBSV在本生烟中的侵染;相反,下调Hsc70-2的表达则严重影响BBSV的复制水平,说明Hsc70-2是BBSV复制所必需的宿主因子。侵染实验发现,CP负调控病毒的复制,破坏CP的RNA结合活性,病毒(BBSVmMP/CP△N21)的复制水平仍显著低于CP缺失突变体(BBSVmMP/mCP)的复制水平,说明CP负调控BBSV的复制还可能存在其他机制。超表达Hsc70-2能降低CP对病毒复制的抑制作用,竞争实验表明CP干扰Hsc70-2与p23间的相互作用,暗示CP的表达会影响病毒复制复合体的形成。这些研究结果表明,BBSV可通过不同组分劫持Hsc70-2这一寄主因子,进而调控病毒的复制和侵染,这为深入理解Hsp70家族蛋白在病毒侵染中的不同作用提供了新的视角。本实验室前期还发现BBSV侵染诱导Hsp17.6上调,沉默Hsp17.6则会降低病毒在本生烟中的侵染。在此基础上,本研究通过热稳定实验证明HsP17.6确实具有分子伴侣活性,组织特异性表达分析显示Hsp17.6主要在植物的种子中表达,其次是植物的根和叶。亚细胞定位分析表明Hsp17.6定位于细胞质,形成大小不一的聚集体且部分聚集体在细胞内会发生移动,有意思的是,BBSV侵染使得Hsp17.6的定位由聚集体形式变为均匀分布,结合BBSV侵染诱导Hsp90上调表达、共表达Hsp90引起Hsp17.6发生类似的定位改变等实验结果,我们认为Hsp17.6定位的变化可能是由于BBSV侵染诱导Hsp90上调表达而间接引起的。超表达Hsp17.6蛋白并不能促进BBSV的侵染,沉默Hsp17.6减弱BBSV的侵染但不影响病毒的复制,暗示Hsp17.6可能在病毒的运动中起作用。BiFC和pull-down实验表明,Hsp17.6与BBSV的运动蛋白p7a存在相互作用;BiFC和Co-IP实验也证明,Hsp17.6与Actin互作,这些实验结果初步表明Hsp17.6可能在介导BBSV运动复合体沿着Actin的运动中发挥重要作用。