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目的肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的80%-85%,是临床最常见的一种类型。由于肺癌在早期缺乏明显的特异性症状,同时易发生血行转移,因此大多数患者在确诊时已进入中晚期阶段,治疗效果及预后均不佳。本课题组在前期通过生物信息学方法筛选出11个基因,其中人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK)在报道中与肺癌发病有重要关系。故本研究通过构建能高效表达人CASK基因的慢病毒载体并对H1299细胞系稳定转染后进行鉴定,并通过对人非小细胞肺癌H1299细胞株进行感染后,研究CASK过表达对其增殖能力和迁移能力的影响。方法1.CASK过表达慢病毒载体的构建采用聚合酶链反应(PCR)扩增CASK基因片段,通过重组反应完成目的基因扩增产物和线性化GV358载体的体外环化。对重组产物进行转化后,挑取单克隆进行PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序分析。最后将正确克隆菌液扩大培养、抽提以获得高纯度质粒。将重组质粒和包装质粒共转染至293T细胞。Western Blot检测转染后293T细胞蛋白表达水平;用酶联免疫吸附实验(ELISA)法进行滴度检测。2.细胞模型效能检测将成功包装的CASK过表达慢病毒LV-CASK(OE组)和阴性对照病毒CON238(NC组)分别感染人非小细胞肺癌H1299细胞,同时设置空白对照组(MOCK组),用荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western Blot法检测CASK表达水平。3.CASK过表达对H1299细胞生物学功能特性的影响实验分组:空白对照组(MOCK组)、CASK过表达组(OE组)和阴性对照组(NC组),NC组和OE组分别用CON238和LV-CASK进行感染,MOCK组不予任何处理,分别使用MTT法和细胞划痕实验观察CASK过表达对H1299细胞增殖能力和迁移能力的影响。结果1.CASK过表达慢病毒载体的构建通过PCR技术成功地扩增CASK基因片段并连接到GV358病毒载体上,PCR及DNA测序鉴定结果证明CASK-GV358质粒构建正确。重组慢病毒转染293T细胞后可观察到绿色荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并测定其浓缩滴度为2×108 TU/m L。2.细胞模型效能检测FQ-PCR和Western Blot检测结果显示,与NC组相比,OE组CASK m RNA和蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。3.CASK过表达对H1299细胞生物学功能特性的影响MTT法结果表明,OE组细胞增殖能力与NC组相比有明显差异(P<0.05),提示CASK过表达对H1299细胞增殖能力有抑制作用;细胞划痕实验结果表明OE组细胞迁移能力与NC组无明显差异(P>0.05),CASK过表达对H1299细胞迁移能力无明显作用。结论成功构建了CASK基因过表达慢病毒载体,可在H1299细胞中稳定表达,CASK过表达可抑制H1299细胞增殖能力,为进一步研究CASK在肺癌中的机制和作用奠定了基础。