【摘 要】
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前列腺癌的诱因主要有遗传、环境、年龄和种族,其中遗传因素是主导因素。SPOP是前列腺癌中点突变频率最高的基因之一,可能在癌症形成早期就发生突变,其突变是前列腺癌发生发展的潜在驱使因子,同时SPOP突变与TMPRSS2-ERG基因重排两个遗传事件在前列腺癌病人中互斥,提示SPOP突变引发的前列腺癌可能具有独特的病理机制。SPOP是E3泛素连接酶接头蛋白,参与特异性底物的识别以及蛋白酶途径介导的蛋白降
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前列腺癌的诱因主要有遗传、环境、年龄和种族,其中遗传因素是主导因素。SPOP是前列腺癌中点突变频率最高的基因之一,可能在癌症形成早期就发生突变,其突变是前列腺癌发生发展的潜在驱使因子,同时SPOP突变与TMPRSS2-ERG基因重排两个遗传事件在前列腺癌病人中互斥,提示SPOP突变引发的前列腺癌可能具有独特的病理机制。SPOP是E3泛素连接酶接头蛋白,参与特异性底物的识别以及蛋白酶途径介导的蛋白降解。SPOP的底物大多是促癌蛋白,其中大部分底物与前列腺癌的发生发展密切相关,如AR、SRC-3、c-Myc和Brd4等。通过酵母双杂交,我们发现应激颗粒蛋白Caprin1是SPOP新的互作蛋白。应激颗粒(Stress Granules,SGs)是真核细胞在逆境条件下形成的富含RNA和RNA结合蛋白的致密颗粒,应激颗粒通过招募相关蛋白或RNA,从而调控多种信号通路。应激颗粒通常处于动态变化中,并促进了肿瘤细胞在逆境条件下的存活。我们推测SPOP可能通过Caprin1调控了应激颗粒的动态变化,进而调控了前列腺癌细胞的应激反应以及前列腺癌的病变过程。为了探究此猜想,本研究从细胞及分子水平展开。具体内容如下:第一部分:SPOP调控Caprin1蛋白的稳定性首先,我们利用酵母双杂交技术筛选得到SPOP的一系列靶蛋白,其中包括应激颗粒成核蛋白Caprin1。随后,利用免疫共沉淀技术验证过表达SPOP与Caprin1或小鼠大脑内源表达的SPOP与Caprin1之间存在相互作用。接下来我们探究了他们相互结合的区域。通过利用系列缺失、基因突变、定点突变、免疫印迹和免疫共沉淀等技术,我们发现SPOP蛋白结合Caprin1蛋白的区域是位于氨基端的MATH结构域;而SPOP蛋白识别Caprin1蛋白的436SSTS439模体。通过构建前列腺相关的SPOP突变体,我们发现SPOP促进了Caprin1蛋白的降解,而前列腺癌相关SPOP突变体不能有效结合并促进Caprin1蛋白的降解。第二部分:SPOP调控Caprin1蛋白的不溶性转变研究报道表明,SPOP蛋白通过液相分离(Liquid-liquid phase separation,LLPS)的方式与其底物共定位到无膜细胞器中。为了验证SPOP是否调控Caprin1蛋白的液相分离,我们探究了SPOP是否调控Caprin1蛋白的不溶性转变。首先,蛋白质免疫印迹实验结果表明SPOP蛋白可以调控野生型Caprin1蛋白,而不能调控SPOP结合缺陷型Caprin1突变(4SA436)的不溶性转变;同时也发现大部分前列腺癌相关SPOP突变也不能调控Caprin1蛋白的不溶性转变(除Y87C外)。因此,我们的实验结果初步表明SPOP可能调控了Caprin1蛋白的液相分离。第三部分:SPOP通过Caprin1蛋白调控应激颗粒及前列腺癌细胞的应激反应研究报道表明,Caprin1蛋白是应激颗粒的重要组分之一,其对应激颗粒的形成很重要。为了探究SPOP是否能通过调控Caprin1进一步来调控应激颗粒的动态平衡。首先,通过亚砷酸盐(Sodium Arsenite,AS)药物刺激细胞及免疫荧光技术发现,SPOP与Caprin1蛋白共定位于应激颗粒中。这些结果表明SPOP可能调控应激颗粒动态平衡。接下来,通过慢病毒介导的RNA干扰技术在He La细胞中建立了SPOP敲低稳定株。通过RT-q PCR发现敲低SPOP不影响Caprin1 m RNA水平,但通过蛋白质印记技术发现Caprin1蛋白水平明显上调。为了解释SPOP可以通过调控Caprin1蛋白来调控应激颗粒的动态平衡,通过AS药物刺激细胞及免疫荧光技术表明,敲低SPOP加速了压力恢复过程中的应激颗粒解聚。为了探究SPOP调控应激颗粒动态平衡对前列腺癌细胞的影响,首先检测了应激颗粒的形成对前列腺癌细胞PC-3活性的影响。通过抑制PC-3在压力下形成应激颗粒,并利用MTT技术发现PC-3细胞存活率明显降低。随后,使用AS刺激SPOP敲低细胞株,结果显示正常癌细胞在AS处理4h后即出现凋亡信号,而SPOP敲低细胞没有明显凋亡信号;正常癌细胞在AS处理8h后出现大量凋亡信号,而SPOP敲低细胞只出现少量凋亡信号。另外通过在前列腺癌细胞系22Rv1中过表达SPOP,实验结果表明过表达SPOP抑制前列腺癌细胞在压力下形成应激颗粒。这些结果表明SPOP通过调控应激颗粒进而调控了前列腺细胞的应激反应。综上所述,通过研究发现,SPOP蛋白通过应激颗粒调控了前列腺癌的发生发展。本研究还发现SPOP蛋白是通过调控Caprin1蛋白的稳定性与不溶性转变,从而参与应激颗粒动态调控,进而影响前列腺的发生发展。此研究为阐明应激颗粒参与前列腺癌的发生发展提供有力证据;有助于深入了解前列腺癌的发病机制,寻找前列腺癌的诊断分子及药物靶点。
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