论文部分内容阅读
研究背景与目的:急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是消化系统常见的危重症之一,发病率逐年升高。约1/5的AP患者会发展成为重症急性胰腺炎(Sever acute pancreatitis,SAP),病死率高,是危害人民健康和生命的重大疾病之一。在SAP的急性反应期常有毛细血管渗漏综合征(Capillary leakage syndrome,CLS)的发生,其是SAP全身炎症反应综合症向全身多脏器功能衰竭的中间阶段。因此,治疗SAP并发的CLS对改善SAP患者的预后具有重要的临床意义。但遗憾的是,目前SAP并发CLS的机制尚不明确,且缺乏有效的治疗方案。目前,研究提示CLS的发生机制是毛细血管内皮细胞的损伤,引起内皮细胞间连接复合体(紧密连接、黏附连接以及跨细胞途径等)的异常,从而导致毛细血管通透性增加。近来研究发现,microRNAs(miRNAs)与胰腺疾病的发生、发展及预后密切相关,我们课题前期发现了与SAP并发症相关的miR-551b-5p。因此,本研究拟通过在细胞水平和生物个体水平中,结合测序、荧光素酶等技术探究miR-551b-5p在SAP并CLS的作用机制。为人们认识在SAP中发生CLS的机制提供新思路。材料与方法:1、探究miR-551b-5p与SAP并毛细血管渗漏的关系1、随机将C57/BL6小鼠分为三组,分别是NC组、Cer组和Cer+LPS组,每组8只。Cer组小鼠单纯使用雨蛙素(Caerulein,Cer),Cer+LPS组小鼠使用Cer 联合脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。2、造模24h后,对各组小鼠进行取材,取材的组织:血清、胰腺、肺、肝、肾、结肠、脂肪。3、生化分析仪检测各组小鼠血清血淀粉酶、脂肪酶的表达差异。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法检测各组小鼠血清中炎症因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)表达差异。4、苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)后,在显微镜下观察各组小鼠的胰腺组织病理形态的变化并评分。5、透射电镜分析各组小鼠胰腺组织的毛细血管内皮细胞的变化。6、通过检测胰腺和肺组织的湿干重比以及组织中的Evans Blue浓度来检测各组小鼠毛细血管渗漏的差异。7、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测正常组及实验组小鼠血清、胰腺、肺、肝、肾、结肠、脂肪组织中miR-551b-5p的表达。2、探究miR-551b-5p在SAP并毛细血管渗漏的作用机制1、构建急性炎症细胞模型,并通过qPCR检测细胞炎症因子(TNF-α和IL-6)的表达水平来测定建模效率。2、对照组和急性炎症细胞模型组中miR-551b-5p表达差异由qPCR检测;同时,运用qPCR及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验测定各组细胞AQP5、Occludin、JAM3和Claudin1的mRNA和蛋白表达差异。3、构建miR-551b-5p mimic和miR-551b-5p inhibitor。使用瞬时转染方法上调和下调细胞中的miR-551b-5p表达水平;转染效率由qPCR方法来检测。4、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分组:空白组、NC-mimic组和miR-551b-5p mimic组。运用荧光黄Transwell实验检测各组细胞的通透性的差异。5、采用鬼笔环肽-FITC染色实验以了解各组血管内皮细胞骨架的形态差异。6、运用 qPCR 和 WB 来检测 NC-mimic 组和 miR-551b-5p mimic 组 HUVEC细胞的紧密连接相关分子(Occludin、JAM3和Claudin1)及跨细胞途径分子(AQP5)的mRNA及蛋白表达差异;同时也进行免疫荧光染色实验检测2组HUVEC细胞Occludin、JAM3蛋白表达的差异。7、构建 AAV8-miR-551b-5p 及 AAV8-miR-551b-5p Spone 以上调和下调小鼠胰腺miR-551b-5p表达。先进行预实验,AAV8分别通过腹腔注射(IP)和尾静脉注射(IV)至小鼠体内以筛选出病毒感染效果最佳的注射途径。qPCR和WB用于检测AAV8转染效率。8、进行正式的动物实验,AAV8-NC及AAV8-miR-551b-5p通过腹腔注射至小鼠体内,3周后再构建SAP动物模型,以进一步探究miR-551b-5p对SAP并毛细血管渗漏的作用。造模24h后,对各组小鼠进行取材的组织有:血清、胰腺组织、肺组织。9、各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6采用ELISA法检测,淀粉酶和脂肪酶使用生化分析仪检测。10、检测胰腺和肺湿干重比以及组织中Evans Blue浓度了解各组小鼠毛细血管渗漏程度的差异。11、各组小鼠的胰腺和肺进行HE染色并显微镜下观察组织的病理形态;取各组小鼠胰腺组织进行免疫组化染色,观测各组小鼠胰腺组织的MPO表达差异。12、qPCR和WB检测各组小鼠胰腺组织中的紧密连接相关分子(Occludin、JAM3和Claudin1)及跨细胞途径分子(AQP5)的mRNA及蛋白表达差异。13、对各组小鼠的胰腺进行组织免疫荧光染色,检测各组小鼠胰腺组织中Occludin和Claudin1蛋白表达差异。3、探究miR-551b-5p在重症急性胰腺炎并毛细血管渗漏中作用的具体分子机制1、制备测序细胞样本:使用瞬时转染方法上调HUVEC细胞miR-551b-5p的表达,转染效率由qPCR方法来检测。2、对mimic-NC组和miR-551b-5p mimic组的HUVEC细胞进行转录组测序,筛选出差异表达基因。3、运用生物信息学对组间差异基因进行差异分析、GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。4、将测序所得的差异基因结合Targetscan、miRBD在线网站工具,共同预测miR-551b-5p可能的靶基因,并筛选出miR-551b-5p在SAP并CLS中作用的相关信号通路。5、qPCR检测对照组和过表达miR-551b-5p组的HUVEC细胞和小鼠胰腺组织中预测靶基因的表达差异,并应用双萤光素酶报告基因检测实验验证miR-551b-5p的靶基因。6、WB检测对照组、过表达miR-551b-5p组和过表达miR-551b-5p再造模组的细胞及小鼠胰腺组织中ERBB3、PI3K/AKT信号通路中关键分子的蛋白表达差异,以探究miR-551b-5p通过靶向ERBB3对PI3K/AKT信号通路的影响。7、回复实验:购买740 Y-P(PI3K激动剂),将HUVEC细胞分为4组,即对照组、miR-551b-5p过表达组、对照+740 Y-P组和miR-551b-5p过表达+740 Y-P组。WB检测上述4组细胞的信号通路中关键分子、靶基因及紧密连接相关分子(Occludin、JAM3和Claudin1)及跨细胞途径分子(AQP5)的mRNA及蛋白表达差异。结果:1、miR-551b-5p与SAP小鼠的毛细血管渗漏及病情严重程度正相关。1、与对照组比较,Cer组和Cer+LPS组小鼠血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-a、IL-6和IL-1β水平明显升高(P<0.05)。此外,相比对照组,Cer组和Cer+LPS组小鼠胰腺和肺组织出现明显病理改变,且损伤程度病理评分明显升高(P<0.05)。这表明Cer组和Cer+LPS组构建的小鼠SAP模型成功。2、相比Cer组,Cer+LPS组小鼠的血清相关指标表达水平(淀粉酶、脂肪酶、炎症因子)和胰腺及肺组织病理破坏程度评分均更高(P<0.05)。此外,Cer+LPS组小鼠的胰腺和肺组织湿干比重及Evans blue渗漏量比Cer组更多(P<0.05)。提示Cer+LPS组小鼠的疾病病情及毛细血管渗漏比Cer组小鼠更严重,Cer联合LPS构建的SAP小鼠模型更适合本研究。3、透射电镜结果显示:相比对照组,Cer组和Cer+LPS组胰腺组织的毛细血管内皮细胞均有改变;其中,Cer+LPS组小鼠的胰腺组织的毛细血管内皮细胞及细胞间连接的破坏明显比Cer组小鼠严重。4、qPCR结果示:相比对照组,Cer组和Cer+LPS组小鼠胰腺、肺和血清中的miR-551b-5p均显著升高(P<0.05),其中Cer+LPS组小鼠的比Cer组的升高的更为明显(P<0.05)。可见小鼠的急性胰腺炎病情、毛细血管渗漏和毛细血管内皮屏障破坏越严重,小鼠的胰腺组织、肺组织、血清中的miR-551b-5p表达越高。5、探究miR551b-5p组织来源,qPCR结果示:在正常小鼠中,miR-551b-5p在各脏器的表达量由高到低依次是:血清、肝脏、胰腺、脂肪、肾脏、肺、结肠。有趣的是,相比对照组及Cer组,Cer+LPS组小鼠脂肪组织的miR-551b-5p表达显著下降(P<0.05)。2、过表达miR-551b-5p可以引起紧密连接相关分子(Occuldin、JAM3和Claudin1)和跨细胞途径分子(AQP5)表达的下调,增加血管内皮细胞的通透性,进而导致SAP的毛细血管渗漏及病情加重。1、构建急性炎症细胞模型后,qPCR和WB结果示:与NC组相比,急性炎症细胞模型的miR-551b-5p表达显著升高;AQP5、Occuldin、JAM3和Claudin1的mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05)。提示急性炎症的发生可以导致miR-551b-5p表达的升高,引起内皮细胞间紧密连接相关分子(Occuldin、JAM3及Claudin1)和跨细胞途径分子(AQP5)表达的下降。2、上调和下调细胞miR-551b-5p,qPCR结果提示,上调细胞的miR-551b-5p成功,而下调细胞的miR-551b-5p失败。3、荧光黄检测细胞通透性实验及免疫荧光实验提示:相比空白组和NC组,miR-551b-5p过表达组细胞的通透性明显增加(P<0.05)。4、鬼笔环肽-FITC细胞骨架染色实验结果观察到,NC组和空白组细胞骨架呈网状,分布均匀,而过miR-551b-5p过表达组细胞骨架相对松散,有明显的空泡细胞。5、qPCR、WB和免疫荧光染色实验示:相比NC组,miR-551b-5p过表达组细胞的AQP5、Occuldin、JAM3和Claudin1 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。6、小鼠预实验:AAV8腹腔注射途径的病毒转染小鼠胰腺效果优于尾静脉注射(IV)途径;过表达小鼠胰腺的miR-551b-5p成功,而下调小鼠胰腺的miR-551b-5p 失败。7、各组小鼠血清相关指标检测,结果示:相比对照组,其他各组小鼠的血清淀粉酶、脂肪酶、炎症因子(TNF-a、IL-1β和IL-6)的表达由高到低依次是AAV8 miR-551b-5p+Cer+Lps 组、AAV8 NC+Cer+Lps 组、AAV8-miR-551b-5p 组及AAV8 NC组。可见miR-551b-5p可以加重SAP小鼠的病情。8、检测各组小鼠毛细血管渗漏及病情,结果示:相比对照组,其他各组小鼠胰腺和肺组织的湿/干重比、组织Evans Blue的浓度、病理变化严重程度以及MPO分布情况由重到轻依次是:AAV8 miR-55 1b-5p+Cer+Lps组、AAV8 NC+Cer+Lps 组、AAV8 miR-551b-5p 组及 AAV8 NC 组。可见 miR-551b-5p 可加重SAP小鼠的病情及毛细血管渗漏。9、各组小鼠胰腺组织qPCR及WB结果:相比对照组,AAV8NC+Cer+Lps组、AAV8-miR-551b-5p 组和 AAV8-miR-551b-5p+Cer+Lps 组胰腺组织中的 AQP5、Occuldin、JAM3和Claudin1基因的mRNA和蛋白表达均显著下降(P<0.05)。其中,AAV8-miR-551b-5p+Cer+Lps 组的 AQP5、Occuldin、JAM3 和 Claudin1 基因表达下降最显著(P<0.05)。提示:过表达miR-551b-5p可进一步加重SAP小鼠胰腺组织中紧密连接及跨细胞途径分子表达的下调。3、miR-551b-5p可通过靶向ERBB3,抑制PI3K/AKT信号通路,从而引起血管内皮细胞间的紧密连接及物质转运分子表达下降,进而加重SAP毛细血管渗漏。1、转录组测序结果共获得261个差异表达基因,其中上调基因有130个,下调基因有131个。2、结合生物信息学分析,预测在SAP并CLS,miR-551b-5p可能是通过靶向ERBB3影响PI3K/AKT信号通路而起作用。3、所有261个差异表达基因的GO和KEGG富集分析提示:主要富集于炎症因子及炎症相关的信号通路,如IL-17信号通路、MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路等。4、qPCR实验结果提示:在HUVEC细胞和小鼠胰腺组织中,相比NC组,过表达miR-551b-5p组的ERBB3表达下降(P<0.05);双萤光素酶报告基因实验提示 miR-551b-5p 作用于 ERBB3 的 3’UTR。提示 ERBB3 是 miR-551b-5p 的靶基因。5、WB实验提示:在HUVEC细胞系和小鼠胰腺组织中,相比NC组,过表达miR-551b-5p组ERBB3、pPI3K和pAKT蛋白表达均下降(P<0.05)。提示miR-551b-5p的过表达可以抑制PI3K/AKT信号通路。6、WB验室示:HUVEC细胞系中,加入740Y-P(PI3K激活剂)可以挽救miR-551b-5p过表达所致的PI3K/AKT信号通路的抑制及紧密连接相关分子的下调。结论:1、miR-551b-5p与SAP小鼠的毛细血管渗漏及病情严重程度正相关2、过表达miR-551b-5p可以引起紧密连接相关分子(Occuldin、JAM3和Claudin1)和跨细胞途径分子(AQP5)表达的下调,增加血管内皮细胞的通透性,进而导致SAP的毛细血管渗漏及病情加重。3、miR-551b-5p可通过靶向ERBB3,抑制PI3K/AKT信号通路,从而引起血管内皮细胞间的紧密连接及物质转运分子表达下降,进而加重SAP毛细血管渗漏。