酶是生物蛋白催化剂,它来源于自然界,并具有高效、专一的催化活性。伴随着科学技术的发展,酶也在诸多领域得到了较为广泛的应用。然而,来源于生命体的游离酶在高温、有机溶剂或极端pH下的不稳定性,使其在工业中的广泛应用受到一定限制。此外,反应体系中游离酶分离和提纯的难度较大,这也增加了其作为催化剂的使用成本。固定化酶技术有效地弥补了这些缺陷,成为解决游离酶利用问题的一个有效途径,并且为酶的深入应用开辟了广阔的前景。与游离酶相比,固定化酶不仅保持了其高效性和专一性的催化反应特性,还具有易分离回收、可重复使用、操作连续、制备工艺简便、增强酶稳定性等一系列优点。石墨烯量子点(GQDs)是尺寸在10 nm以下的零维纳米材料。相对于二维的石墨烯纳米片和一维的石墨烯纳米带,它除了具有比表面积大、载流子迁移率高、化学稳定性良好、对环境友好的特征之外,还具有量子限制效应和边界效应的特点。相对于传统的石墨类化合物,GQDs具有独特的荧光性质,可以根据粒径光致发射不同波长的荧光,吸引了各个领域研究者的关注。目前,GQDs已在生物医药、太阳能光电器件、发光二极管和生物酶传感器等诸多领域有了越来越广范的应用。本论文首先制备氨基化PGMA/EDMA微球,并分别通过SEM和压汞法对微球表面形貌和孔径分布进行了表征。随后使用两种不同的酶固定化方法,分别将α-淀粉酶和p-葡萄糖苷酶固定化到氨基功能化的微球上,并分别对酶的固定化条件和稳定性进行了优化和考察。随后,利用碳化二亚胺(EDC)和N-琥珀羟基酰亚胺(NHS)的交联化反应,分别将乙酰胆碱酯酶(AChE)和α-葡萄糖苷酶固定化到GQDs表面,并利用GQDs的荧光特性,建立基于GQDs荧光的纳米生物酶传感器,用于两种酶的定量分析及其抑制剂筛选。主要研究内容及结论如下：1.采用单分散聚合法制备PGMA/EDMA微球,并用乙二胺作为氨基化试剂将氨基接枝在微球表面,随后使用交联剂戊二醛,将α-淀粉酶成功共价交联固定化到氨基化微球上,固定化效率为35.1 mg/g。随后对固定化酶的操作条件和稳定性进行了研究。与游离酶相比,固定化酶的米氏常数和最大反应速率分别提高了12.94 mgmL-1和0.124 mmol mL-1min-1。同时耐酸性增强,90℃下的热稳定性由40%增加到61%,9次重复操作之后仍可保留58%的初始酶活性。最适宜条件下保存180 min后,固定化酶和游离酶的活力分别保持在80%和10%以上。2.对游离酶采用吸附、沉淀、交联的顺序,制备了聚合交联固定化β-葡萄糖苷酶,并对制备固定化酶的操作条件进行了优化。结果表明,固定化酶的两个动力学参数值Km和vmax分别为7.67μm和0.639μmol mL-1min-1,表明固定化酶比游离酶更具底物亲和性；最佳使用pH值和温度分别为5.5和60℃；连续重复使用9次后,固定化酶剩余活性仍然保持在90%以上；70℃条件下水浴恒温180 min后,固定化酶活力保持在80%以上,300 min后剩余50%初始活性；放置冰箱4℃储存,30 d后固定化酶剩余初始活性达到80%以上。最后,用纤维二糖作为底物进行水解,相对于游离酶,固定化酶极大地提高了纤维二糖的水解速率,由4h缩短至1 h,具有潜在的食品和生物乙醇生产的实际应用价值。3.利用EDC和NHS的交联作用,将AChE固定化到GQDs表面,同时GQDs的荧光也随之增强。随后用Hg2+将增强后的荧光猝灭,再利用酶解反应释放的胆碱化合物和Hg2+作用,形成Hg-S键,将GQDs-Hg2+体系解离,释放出GQDs,荧光得以恢复。根据以上原理设计了GQDs荧光纳米生物酶传感器,通过“荧光开关”现象建立了AChE的分析方法,线性范围为10-5～10-2U,检测限为2.3×10-6 U,并选用对氧磷和塔克林两种AChE抑制剂,对体系进行了酶活性抑制实验,得到两种模型抑制剂的半数抑制有效浓度分别为63.76 nM和14.07 nM。证明了基于GQDs增强荧光的纳米传感器可以对AChE进行活性分析,并且可以作为潜在的AChE抑制剂筛选工具。4.利用EDC和NHS的交联作用,将a-葡萄糖苷酶交联固定化到GQDs表面,再向体系中加入酶底物pNPG,水解后产生pNP,猝灭GQDs的荧光,猝灭率与酶的加入量呈线性关系,建立了α-葡萄糖苷酶分析方法,计算得出a-葡萄糖苷酶的线性检测范围为10-3～10-1 U,检测限为1.7×10-4 U。最后利用阳性药物阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶进行了活性抑制实验。实验结果表明,GQDs荧光纳米生物酶传感器可以对α-葡萄糖苷酶进行高灵敏度的活性检测,并且对其抑制剂的筛选具有进一步的利用价值。