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杨树是我国重要的树种之一,它生长速度快,易繁殖,在木材工业?纸浆业和绿化带建设中广泛应用,是人工林和大面积速生商品林建设的首选树种? 本研究建立了美洲黑杨 G2 叶片培养诱导芽再生的体系,确立了分化再生芽的最适宜培养基,生根培养基?通过农杆菌介导首次依次将反义磷脂酶 Dγ(Anti-PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨 G2中,获得了耐盐性及抗病性均显著提高的转基因植株? 研究结果表明附加 6-BA 0.5 mg·L-1, NAA 0.1 mg·-1的 MS 培养基可 L以高频诱导不定芽的产生?在叶片背面划三刀,但不切断叶片,置于分化培养基上培养,5 d 后叶片体积开始增大,15 d 左右露出芽点,不定芽出现的高峰期在接种后的 20~30 d?待小芽长至 2~3 cm后,转移到生根培养基(1/2MS+0.02 mg ·L-1NAA)上诱导生根,10 d 左右即产生根,最终得到完整的植株? 分别进行了抑菌性抗生素头孢霉素和选择性抗生素卡那霉素与潮霉素的敏感性试验,结果表明头孢霉素(Cef)400 mg·-1即能有效抑制农杆 L菌过度繁殖,叶片外植体分化未受到明显的抑制作用?Km 20 mg·L-1 ,Hyg 10 mg·L-1可作为诱导叶片芽分化临界筛选浓度?Km30 mg·L-1,Hyg 10mg·L-1可作为生根时筛选抗性植株的使用浓度? 优化了农杆菌介导的美洲黑杨 G2 遗传转化体系?具体做法是:选取生长 2~3 周的健壮杨树组培苗叶片,在远轴面用解剖刀划伤但不切断,预培养 3 d?将培养至对数生长期的农杆菌(OD600=0.3)菌液用 1 倍的 5%蔗糖溶液(内含表面活性剂 Silwet-77 0.02%)稀释成侵染液?叶片转入侵染液中,不停地轻轻摇动三角瓶 5~7 min 后,将叶片均匀放入装有用 5%蔗糖饱和的滤纸的培养皿中,置于 20℃暗箱中放置 12 h?,将叶片转入含有用液体叶分化培养基饱和的滤纸的培养皿中共培养 3 d?出现肉眼可见的菌落后,用无菌水冲洗 3~4 次后转接到含头孢霉素 400 mg·L-1的固体抑菌培养基上? 1<WP=9>反义磷脂酶 Dγ基因与几丁质酶基因转化杨树的研究 首先转入反义磷脂酶 Dγ基因,经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株?抗性植株经PCR及PCR-Southern杂交检测,有 13 株均呈阳性,证明 Anti-PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2 基因组中?耐盐性实验表明,4 株转基因植株抗 NaCl能力比对照都有不同程度提高?选择 4 号转化苗进行扩繁,用做继续转入几丁质酶基因的受体,通过潮霉素筛选不定芽及诱导生根获 6 株潮霉素抗性植株,经 PCR及 PCR-Southern 杂交检测,6 株均呈阳性,证明 CH5B 基因成功整合到美洲黑杨 G2 基因组中?由于 CH5B 基因与报告基因 GUS 处于同一开放阅读框(ORF)内,因此通过 GUS 基因的组织化学染色分析,可以间接证明几丁质酶基因也获得表达?分别取转化植株的叶片和未转化植株叶片制备粗酶液,通过化学检测法显示:转基因植株叶片中几丁质酶的产量比对照(非转基因植株)高,说明外源基因己在转基因植株中进行表达? 一批转基因植株已移栽到温室,现生长良好?转基因苗在经过 72 h 1%NaCl 胁迫后,相对电导率为 20%左右,而非转基因植株高达 40%,表明转基因植株在盐胁迫下受到的伤害较非转基因的轻,并且转基因植株能够在含有 0.5% NaCl 的 Hoagland 溶液中正常生长 2 周以上,而非转基因植株则呈现不正常生长?