舒脑欣治疗慢性脑缺血的作用机制研究

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目的:  慢性脑缺血是一种常见的病理状态,伴发于多种脑血管病的病理过程中,中医多使用活血化瘀中药予以治疗。但由于中药的多成分、多靶点、多途径的特点,其作用机制尚不明确。本研究以舒脑欣为研究对象,利用高通量筛选及其建立动物模型的方法,分析其药效物质基础,确定其作用机制,为明确舒脑欣的作用机理提供实验支持。  方法:  1.结合中医传承辅助系统,分析常用治疗头痛的中药及其配伍规律,为临床用药提供实验依据。  2.利用UPLC-Q/TOF,对舒脑欣中主要化学成分进行鉴定,并应用pharmmapper预测其作用靶点,进而确定其调控的信号通路。  3.运用UPLC-Q/TOF结合萤光素酶报告基因检测系统筛选舒脑欣中抑制NF-kB、拮抗Ca2+、激动(32受体、调控ATP的活性物质,确认舒脑欣的药效作用物质基础。  4.建立永久性结扎双侧颈总动脉(2VO)慢性脑缺血大鼠动物模型,利用脑血流仪以及激光多普勒成像系统,对模型大鼠脑血流进行监测。运用Elisa试剂盒检测模型动物血清中多种因子含量。观察He染片病理切片分析舒脑欣对脑组织的影响。  5.运用基于RNA-Seq的转录组分析差异表达基因,并运用western blot进行验证。结合KEGG分析舒脑欣的作用通路及其作用机制。  结果:  1.通过分析常用治疗头痛中药方剂,得到川芎、甘草、当归、白芷四味常用中药,并深入分析其配伍规律,表明中医治疗头痛多以解表祛邪、活血化瘀中药配伍使用。  2.通过UPLC/Q-TOF鉴定出舒脑欣中化学成分21种,预测其中可被人体吸收19种,包括阿魏酸、川芎内酯、藁本内酯、川芎嗪等,并通过网络药理学研究表明,舒脑欣通过调控CHRM1、OPRM1等30个潜在靶点,作用神经活性的配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、妈信号通路(Calcium signaling pathway)等10条信号转导通路。  3.本研究对舒脑欣中抗炎、拮抗钙离子、调控ATP的有效成分进行了筛选与验证,结果得到5种活性抗炎成分,分别为阿魏酸、藁本内酯、川芎嗪、洋川芎内酯I、二聚藁本内酯。3个钙离子拮抗剂和3个调控ATP成分,均为阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯I。  4.通过检测大鼠脑血流,结果表明舒脑欣可以增加慢性脑缺血模型大鼠的脑血流量;Elisa分析显示,舒脑欣可以增加慢性脑缺血大鼠血清中的CAT、SOD的含量,降低异常升高的TNF-a和MPO的含量;对H e染色切片的观察表明舒脑欣对慢性脑缺血大鼠的脑组织结构破坏具有保护作用。  5.结合基因芯片技术分析,舒脑欣可以上调手术后大鼠的F o x o3、Setd7、Ad cy1等46个差异基因,运用western blot验证其作用的勒点蛋白PDK1,结果显示舒脑欣可以降低PDK1的磷酸化。结合kegg通路注释分析,舒脑欣可调控PI3K-AKT、MAPK signaling pathway等信号通路发挥作用。通过与阳性药对比差异基因的表达量,推测舒脑欣还可能通过调控PKA-CREB、Long-term potentiation、Neurotrophin signaling pathway信号通路发挥作用。  结论:  1.通过中医传承辅助系统结果,并结合临床用药规律,明确中医药治疗血瘀头痛常用药对为川芎当归、治疗外感头痛常用药对为白芷川芎,为中药治疗头痛合理用药提供理论依据。  2.舒脑欣中主要药效成分可能为阿魏酸、藁本内酯、川芎嗪、洋川芎内酯I等。  3.舒脑欣可通过抗炎、抗脂质过氧化、增加血流量而起到保护受损脑组织的作用。其作用可能与阿魏酸、藁本内酯、川芎嗪调控Foxo3、Setd7等基因表达作用PI3K-AKT signaling pathway、Calcium signaling pathway、Neurotrophin signaling pathway等信号通路发挥抗炎、神经保护、扩血管的作用有关。
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