随着纳米二氧化硅职业暴露、环境暴露及医源性暴露机会的不断增加，其对人群健康及环境的潜在危害和毒理学安全性评价逐渐受到了科学界的广泛关注。前期研究表明，纳米二氧化硅颗粒具有细胞毒性，可以诱发ROS、引起细胞氧化应激，造成细胞膜、线粒体及DNA损伤，影响细胞周期进程并诱导细胞凋亡。纳米二氧化硅颗粒致细胞多核作用是本研究组在前期工作中观察到的重要实验现象。颗粒是如何导致细胞多核形成的？形成的多核细胞最终的结局是什么？是否能够引起细胞异常增殖及更为严重的生物学后果？以上几点都是目前尚未明确并亟待回答的问题。因此，本研究首先在体外、体内条件下，对纳米二氧化硅颗粒致细胞多核的形成方式及其相关机制进行了系统探讨，以期为颗粒致多核作用的深入研究提供理论及实验依据。1.纳米二氧化硅颗粒的表征及分散稳定性研究中使用的两种无定形纳米二氧化硅颗粒（Nano-Si64及Nano-Si46）纯度均在99.9%以上，粒径分别为63.88±10.35nm及46.15±5.53nm。透射电镜及Zeta电位粒度分析仪的检测结果表明，两种纳米二氧化硅颗粒呈椭球形，大小均一，在纯水及1640培养基中均能够保持良好的稳定性，并未发生聚集。2.纳米二氧化硅颗粒剂量依赖及粒径相关的细胞毒性作用体外实验以人正常肝细胞（L-02）作为受试细胞系，首先对Nano-Si64及Nano-Si46的细胞毒性作用进行检测。分别采用CCK-8试剂盒及台酚蓝染色法检测浓度梯度为0、1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL的两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后对细胞存活率的影响。两种检测方法得到的细胞存活率趋势基本一致，结果表明纳米二氧化硅颗粒对L-02细胞存在剂量依赖及粒径相关的细胞毒性作用，即颗粒的给药剂量越高其对L-02细胞的生长抑制作用越强，粒径较小的纳米二氧化硅颗粒表现出了更强的细胞毒性作用。3.纳米二氧化硅颗粒的细胞摄取及分布10、20、50μg/mL的两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后，分别采用FCM及ICP-AES检测细胞内颗粒度及硅含量的变化。结果表明，随作用剂量的升高，进入细胞内部的二氧化硅颗粒数目逐渐增加，同时细胞内可检测到的硅含量也是在不断升高的，并且粒径较小的颗粒更容易进入细胞内部。进一步采用TEM对纳米二氧化硅颗粒的细胞摄取及分布进行检测。结果表明，两种纳米二氧化硅颗粒均可通过细胞内吞及损伤细胞膜的方式进入细胞内部，并且既可散在或成簇的分布于细胞质中，也可沉积于溶酶体、线粒体等细胞器中。4.纳米二氧化硅颗粒对细胞形态及超微结构的影响10、20、50μg/mL的两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后，首先使用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况及Giemsa染色后细胞的形态变化。结果表明，随作用剂量的增加，两种纳米二氧化硅颗粒对细胞形态结构的影响逐渐明显，可见变小、变圆的细胞逐渐增加，贴壁细胞逐渐减少，高剂量组还可观察到细胞核内染色质聚集及细胞死亡等现象。进一步通过SEM及TEM对L-02细胞的超微结构进行观察，可见纳米二氧化硅颗粒粘附于细胞表面，并引起微绒毛的数量减少及结构断裂；进入细胞后，颗粒能够引起细胞内线粒体、粗面内质网及溶酶体等多种亚细胞结构的异常改变。5.纳米二氧化硅颗粒对细胞的氧化损伤作用10、20、50μg/mL的两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后，细胞内ROS的检测结果表明，两种颗粒均可引起细胞内ROS水平的升高，并且存在剂量依赖及粒径相关效应。进一步对细胞内抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性及脂质过氧化产物MDA的含量进行检测，结果表明两种纳米二氧化硅颗粒随作用剂量的升高，均可使L-02细胞内的氧化压力不断上升，颗粒对细胞的氧化损伤程度逐渐增强，并且小粒径颗粒对细胞的氧化损伤作用更加明显。6.体外条件下纳米二氧化硅颗粒的致多核作用及其相关机制10、20、50μg/mL的两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后，对双核及多核细胞发生率的统计结果表明，二氧化硅颗粒的致多核作用同样存在剂量依赖及粒径相关效应，随作用剂量的增加，实验组内双核及多核细胞的数量明显增加，并且Nano-Si46的致多核作用明显强于Nano-Si64。在细胞融合的检测中，对培养液中LDH活性及细胞内Ca+浓度的检测结果表明，两种纳米二氧化硅颗粒均可引起L-02细胞膜的损伤及细胞内Ca+浓度的升高，并且存在剂量依赖及粒径相关效应。细胞膜的损伤及Ca+浓度的升高为细胞融合的发生提供了可能，但采用实时倒置相差显微镜及激光共聚焦显微镜进行多次观察后，并未发现有两个相邻细胞通过膜的相互连接融合成一个细胞的现象。在细胞有丝分裂异常的检测中，分别采用Actin tracker green、Tubulin trackergreen及Hoechst33258对细胞骨架成分中的微丝、微管及细胞核进行标记，荧光显微镜及激光共聚焦显微镜的观察结果表明，两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后，均能够引起细胞内微丝及微管数目的降低及其在细胞内分布位置的改变；在L-02细胞进行有丝分裂的过程中，可观察到纳米二氧化硅颗粒引起了中期染色体排列的异常、后期染色体分离的异常以及末期胞质分裂的异常，进而导致细胞有丝分裂过程的失败，形成一个双核或多核细胞。另外，细胞有丝分裂过是一个耗能过程，细胞内ATP能量供应不足也可能是细胞有丝分裂失败的原因之一。研究中进一步通过JC-1荧光探针对L-02细胞内的线粒体膜电位进行检测。结果表明，两种纳米二氧化硅颗粒均能够引起细胞内线粒体膜电位的降低，并且膜电位降低的趋势与多核发生率的趋势相符。细胞核内DNA的损伤及其引起的细胞增殖障碍和G2/M周期阻滞可能是细胞多核形成的又一重要因素。采用流式细胞术对细胞增殖及细胞周期进行检测，结果表明两种纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞24h后，的确引起了细胞增殖障碍及G2/M期阻滞。Western blot对细胞内增殖及周期相关蛋白含量的检测结果表明，与增殖相关的p-MEK1/2及p-ERK1/2的蛋白含量随颗粒作用剂量的增加而不断降低，与G2/M及有丝分裂相关的Cdc25C、cyclin B1、Cdc2及Cdc20的蛋白含量也是随纳米二氧化硅颗粒作用剂量的增加而逐渐降低。综上所述，纳米二氧化硅颗粒作用于L-02细胞后，可因其自身的表面活性或诱导产生ROS，引起细胞内DNA、线粒体及骨架结构的损伤，细胞增殖及周期相关蛋白含量的降低，进而通过细胞有丝分裂异常、细胞增殖障碍及G2/M期阻滞，而导致细胞多核的形成。7.体内条件下纳米二氧化硅颗粒的肝损伤作用及致多核作用使用64nm二氧化硅颗粒对ICR小鼠进行尾静脉注射，通过Dixon上下法计算其LD50估计值为262.45±33.78mg/kg。急性毒性研究以LD50估计值为基础等差向下选择了高、中、低三个剂量，即177.5、103.5及29.5mg/kg，经小鼠尾静脉注射后观察14d。亚急性毒性研究以20mg/kg作为实验剂量，连续5次注射后累积剂量为100mg/kg，观察时间分别为2w、4w及8w。病理组织学检测中观察到小鼠肝脏出现了以炎细胞浸润及肉芽肿形成为主的病理改变。急性毒性实验中，小鼠肝脏肉芽肿的数量及面积与纳米二氧化硅颗粒的剂量有关，随颗粒作用剂量的升高，小鼠肝脏病理变化逐渐明显。亚急性毒性实验中，给药后4w小鼠肝脏中形成肉芽肿的数量最多、面积最大，至给药后8w肉芽肿的数量及面积均有所减少。对小鼠肝脏实质双核及多核细胞的统计结果表明，纳米二氧化硅颗粒急性或亚急性给药后，并未引起肝脏多核细胞数目的增加，并且在急性毒性实验的高剂量组还观察到了多核细胞数目的降低，亚急性毒性实验中观察到多核细胞数目随时间延长而逐渐降低的现象，这可能与颗粒对小鼠肝脏的损伤作用有关。进一步对纳米二氧化硅颗粒引起肝脏损伤作用的机制进行初步研究。采用免疫组化的方法对小鼠肝脏切片中细胞内的DNA氧化损伤进行检测，结果表明颗粒经小鼠尾静脉到达肝脏后，并未对肝实质及肉芽肿区域细胞的DNA产生氧化损伤作用。但细胞凋亡的检测中观察到，急性毒性实验中，高剂量组可引起肉芽肿区域细胞凋亡的发生，亚急性毒性实验中，4w时肉芽肿内凋亡细胞数目较多，至8w时已观察不到细胞凋亡的阳性染色。综合上述体内实验的研究结果，纳米二氧化硅颗粒通过ICR小鼠尾静脉急性或亚急性给药后，均可对小鼠肝脏产生损伤作用，引起炎性细胞浸润及肉芽肿的产生。急性毒性实验中，随颗粒作用剂量的不断升高，肝脏肉芽肿的数目及面逐渐增加，而肝实质多核细胞数目逐渐减少；亚急性毒性实验中，肝脏肉芽肿在4w时表现的最为明显，继续观察至8w时，肉芽肿已处于逐渐恢复的阶段，而随着观察时间的不断延长，肝实质多核细胞数目是在逐渐降低的，因此，不排除肝实质细胞损伤逐渐严重的可能性。