E.coli poly(A)化mRNA克隆及基因芯片在其基因生物学功能研究中的应用

来源 :第一军医大学 南方医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:topccb
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现在普遍认为细菌许多mRNA 3’端存在多聚腺苷酸尾,但其长度通常较短,大约在15-60腺苷酸残基范围,且对某一mRNA而言,仅有2-60%的分子被多聚腺苷酸化。细菌mRNA多聚腺苷酸化的位点多种多样,包括初级转录产物的3’末端,3’端非翻译区和顺反子间区的内切酶加工位点及mRNA降解产物的编码区内,其腺苷酸化相对无特异性、无选择性。 针对细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性,利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性,以oligo(dT)—cellulose纯化mRNA,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,并应用限制性显示PCR技术成功地克隆了171个基因片段。利用所收集的基因片段制备基因芯片,并利用该芯片进行了初步的差异基因表达分析(热休克和常规37℃培养)。 实验研究发现限制性显示PCR技术可以很好地用于细菌的poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库的构建,巧妙地解决了由于细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性,用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。对文库基因片段的测序鉴定结果表明应用限制性显示PCR技术构建的文库基因片段的重复性低,筛选基因片段效率高、目的性强。利用克隆所得的基因片段制成的芯片,初步进行了大肠杆菌在热休克状态下的基因差异表达分析,发现热休克处理后,大肠杆菌mRNA的多聚腺苷酸化作用受到明显的抑制。另外在对文库的测序鉴定中还发现了murB和birA基因存在转录通读现象。
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