维生素B12(Vitamin B12,VB12)又叫钴胺素,其外观因含有金属钴元素而呈深红色。动物源内脏中含有大量的维生素B12,在牛奶、鱼以及蛋黄等食品中也有较为广泛的存在。植物体内不含维生素B12。人体自身无法合成维生素B12,但是许多微生物如根瘤菌,放线菌以及肠道细菌等可以合成。维生素B12是维生素产品中价格最昂贵的品种之一。它能参与到血细胞发育的活动中,并且在生物体的代谢活动中也有它的身影。从人体婴幼儿时期,再到成年人时期中,维生素B12发挥着至关重要的作用。同时,在预防并治疗恶性贫血、偏头疼、口内炎等疾病上也有一定功效。国际上对其需求量一直位于维生素家族前列,但产量却常常位于维生素系列产品的末位。工业上维生素B12主要采用费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）和脱单假单胞菌（Pseudomonas denitrificans）等常见菌株来生产。在本研究中,实验菌株黏着剑菌（Ensifer adhaerens）D4-2是“微生物多样性研究与应用河北省重点实验室”保藏的菌种,其能以好氧发酵工艺生产维生素B12。对其维生素B12代谢途径以及氨基酸代谢途径进行综合分析的基础上,确定了本次维生素B12产生菌选育的策略及需要进行遗传操作的靶基因。即,过表达cob A基因,以能够促进尿卟啉原Ⅲ的向下代谢,避免尿卟啉原Ⅲ的积累;敲除cys G基因,阻止前咕啉-2向其他代谢的流动;敲除ilv A基因,阻止苏氨酸向其他代谢途径的流动,从而提高维生素B12的产量。据此,本研究以E.adhaerens D4-2为出发菌株,通过表达载体p BBR1mcs-5进行基因的过表达;基于两次同源重组,以蔗糖致死基因sac B为筛选标记进行基因的无痕敲除,从而获得维生素B12代谢工程菌株。首先,构建了过表达cob A基因的改造菌株,得到菌株Strain 1（D4-2 p BBR1mcs-cob A）;在菌株Strain 1基础上叠加敲除cys G基因得到菌株Strain 2（D4-2 p BBR1mcs-cob A△cys G）;以Strain 2为基础,敲除ilv A基因得到菌株Strain 3（D4-2 p BBR1mcs-cob A△cys G△ilv A）;对E.adhaerens D4-2出发菌株以及实验中构建的3株突变株采用摇瓶发酵培养、HPLC检测维生素B12含量。其中,D4-2菌株维生素B12产量为0.230±0.001mg/m L;Strain 1维生素B12含量为0.244±0.001 mg/m L,比D4-2菌株提高了6%;Strain 2维生素B12含量为0.276±0.001 mg/m L,比D4-2菌株提高了20%;Strain 3维生素B12含量为0.308±0.001 mg/m L,比D4-2菌株提高了34%。本研究通过基因工程手段提高了出发菌株E.adhaerens D4-2维生素B12的含量,并摸索出了一套适用于黏着剑菌基因过表达、基因敲除的代谢工程操作系统,为改造黏着剑菌提高维生素B12含量提供另一种途径。