帕金森病(Parkinson Disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病。PD的发病机制十分复杂,目前认为其是由遗传因素与环境因素的共同作用所导致的。PD遗传致病机制的研究已取得了明显进展,迄今已定位了16个PD相关位点,克隆了11个PD致病基因,其中包括富亮氨酸重复激酶2基因(Leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2),该基因不仅是常染色体显性遗传性PD重要致病基因,还与部分原发性PD有关。目前LRRK2基因突变导致PD发生的机制仍不清楚,但已有的研究提示某些LRRK2致病突变(如G2019S)可能引起其功能增强而具有细胞毒性作用,而且过表达野生型LRRK2也可产生细胞毒性作用。此外LRRK2可能参与PD发生过程中异常蛋白沉积。过表达野生型LRRK2、LRRK2的PD相关突变G2019S或LRRK2激酶结构域加速a-Synuclein A53T的聚集。由此可见,对LRRK2的表达和功能的精确调控是维持机体稳态所必需的,调控机制的异常可能导致疾病的发生,因此我们从分离LRRK2基因启动子开始,展开对其转录调控机制的研究。方法：在数据库中查询LRRK2基因相关的序列信息,运用多种在线软件对LRRK2基因的转录起始位点、第一个外显子和启动子进行预测。在预测结果的基础上,设计7个不同长度的缺失片段(它们分别是-941/-1、-659/-1、-659/-143、-530/-143、-426/-143、-332/-143、-232/-143,其中的-941／-1片段包含LRRK2基因启动子的全长预测片段,-659／-1片段将全长片段从5’端向3’端截短至预测CpG岛的5’端上游,-659／-143片段包含LRRK2基因的CpG岛,此后的缺失片段为在此基础上从5’端向3’端每隔100bp左右依次截短),构建荧光素酶报告基因载体,通过在SH-SY5Y细胞和Hela细胞中进行各缺失片段的瞬时转染及荧光素酶活性分析,确定启动子所在区域。并运用MatInspector对LRRK2基因核心启动子可能的顺式元件进行生物信息学分析,为将来顺式元件的鉴定及转录调控研究奠定基础。结果：本研究对LRRK2基因在脑组织中表达的最主要剪切本ENST00000298910进行分析,以LRRK2基因的RefSeq序列NM 198578的蛋白翻译起始位点“ATG”的A碱基为+1位进行描述。结果显示-530／-143间的387bp在2个细胞株中具有最强的启动活性；将片段-530/-143自5’向3’方向截短后,启动活性在两个细胞株中均明显下降,但最短的缺失片段(-232／-143)在2个细胞株中的启动活性仍显著高于pGL3-Basic的基础值(p<0.05),因此-232/-143间的89bp很可能存在LRRK2基因的基础启动子,其在神经细胞及非神经性细胞中均能启动报告基因的表达。将片段-530／-143自5’向3’方向缺失104bp后,启动活性在两个细胞株中均明显减弱(p<0.05),因此推测在-530至-426区间可能存在具有正性调控启动活性的顺式作用元件；将片段-659/-1自3’向5’方向截短142bp得到片段-659／-143,其启动活性明显增强(p<0.05),而片段-659/-143自5’向3’方向截短129bp得到片段-530／-143,其启动活性也增强(p<0.05),因此推测-143至-1区间、-659至-530区间可能存在负性调控启动活性的顺式作用元件。将片段-426/-143自5’向3’方向截短94bp得到片段-332/-143,其启动活性在Hela细胞减弱(p<0.05),而在SH-SY5Y细胞中无明显变化(p>0.05);将片段-332/-143自5’向3’方向截短100bp得到的片段-232／-143,其启动活性在Hela细胞中增强(p<0.05),而在SH-SY5Y细胞中则减弱(p<0.05),因而推测-426至-232区间可能存在一些与不同组织差异性表达有关的顺式作用元件。结论：本研究中,我们确定了LRRK2基因启动子的位置、并对启动子的活性和特征进行了分析,为进一步深入研究LRRK2基因的转录调控机制奠定了基础。α-半胱氨酸串蛋白(Cysteine-string protein-α,C5P-α)是一种突触前囊泡相关蛋白和分子伴侣蛋白,该蛋白参与突触的生长、突触囊泡的运输和对接,并参与大多数突触的成熟、维持及调节。CSP-α基因敲除小鼠出现严重的神经退行性病变和死亡。在CSP-α基因敲除小鼠中过表达人野生型共核蛋白(α-synuclein)和A53T突变型α-synuclein均可减轻CSP-α基因敲除所导致的表型,因此CSP-α与α-synuclein存在功能相关性。共核蛋白基因(SNCA)已被证实是PD的致病基因,它编码的蛋白α-SVnuclein在PD的发病机制中起着非常关键的作用。这些研究结果提示我们CSP-α可能在PD的发病过程中起作用。因此我们在PD患者中对CSP-α基因进行突变筛查,以分析该基因是否参与PD的发病。方法：对CSP-α基因的外显子2-5设计引物进行PCR扩增,采用PCR产物直接测序法在173例中国汉族PD患者中对该基因的编码区(外显子2-5)及外显子-内含子交界区进行突变筛查；由于在患者中,位于CSP-α基因的外显子2和外显子3存在基因变异,因此我们还在273例无神经系统疾病的对照组受试者中对该基因的外显子2、3进行突变筛查。结果：在CSP-α基因编码区中,我们未检测到错义突变,但检测出5个变异,其中2个是位于编码区的同义突变(exon2的c.75C>T和exon3的c.144C>T)；其他3个位于内含子,分别是位于intron2的c.107+41c>g及位于intron3的c.321+20c>t和c.321+133a>g,其中c.321+20c>t和c.321+133a>g为已知多态,c.107+41c>g为一罕见变异,仅在一例36岁以震颤为主要临床表现的女性散发患者中发现该变异,在273例正常人中未能发现该变异的存在。4种多态(c.75C>T,c.144C>T,c.321+20c>t和c.321+133a>g)的基因型和等位基因频率在173例PD患者和273例对照组受试者之间不存在差别(p值均>0.05)。结论：在中国汉族PD患者中,未发现CSP-α基因编码区及剪切位点存在致病突变,CSP-α基因突变可能不是中国PD患者的主要致病原因。神经调节蛋白受体降解蛋白1(neuregulin receptor degradation protein 1, Nrdp1)是一种泛素E3连接酶,属RBCC (N-terminal RING finger/B-box/coiled coil)蛋白亚家族成员。Nrdp1与受体酪氨酸激酶家族成员-神经调节蛋白受体ErbB3及ErbB4互作,通过调节神经调节蛋白受体在细胞表面的稳定性,而影响细胞的生长、增殖及分化过程,并与肿瘤的发生有关。Zhong等通过酵母双杂交实验,在果蝇pACT2 cDNA中鉴定出Nrdp1为Parkin的互作蛋白。Nrdp1通过泛素-蛋白酶体系统降解Parkin,即Parkin是Nrdp1的一个泛素化底物,并且Nrdp1可能通过作用于Parkin而影响线粒体功能。Parkin是遗传性PD最为重要的致病基因之一,在早发性和散发性PD的发病机制中也起着重要的作用。Parkin蛋白是一种E3泛素连接酶,通过降解特定易聚集且具有神经毒性的底物,抑制神经元凋亡,并参与维持线粒体正常功能以及介导细胞对异常线粒体的清除,在PD的发病机制中起着关键作用。由此,我们推测Nrdp1可能在PD发生过程中起作用,因此我们在PD患者中对Nrdp1基因进行突变筛查,以分析该基因是否参与PD的发病。方法：对Nrdp1基因的外显子3-7设计引物进行PCR扩增,采用PCR产物直接测序法在209例中国汉族PD患者和302例健康对照者中对该基因的5’UTR区(外显子1-2)、蛋白编码区(外显子3-7)及外显子-内含子交界区进行突变筛查。结果：在Nrdp1基因编码区(外显子3-7)中未发现序列变异,在5’UTR区和第一内含子区中发现2个未报道的变异：c.-206 T>A与c.-208-8A>G。我们进一步在无神经系统疾病的对照组受试者中对这2个变异进行检测,并进行病例-对照相关分析,结果显示c.-206 T>A不论是等位基因频率还是基因型频率在PD患者与对照组间均不存在显著差异(p>0.05)；而c.-208-8 A>G变异仅在1例PD患者中检测到,并未在对照组中检测到。结论：在中国汉族PD患者中,未发现Nrdp1基因编码区及剪切位点存在致病突变,Nrdp1基因突变可能不是中国PD患者的主要致病原因。泛素-特异性蛋白酶24(USP24)是泛素-特异性蛋白酶家族的成员,其功能是将多聚泛素从靶蛋白上移走,防止靶蛋白被蛋白酶体降解,而蛋白酶体降解系统异常及蛋白聚集是参与帕金森病(PD)发病的关键机制；此外,在1p32已定位了PD遗传易感位点PARK10,至今未在该位点克隆出PD致病基因,而USP24基因位于PARK10上。尽管有学者用单核苷酸多态(SNP)在患者与正常人间进行了相关分析并得出USP24基因与PD相关的结论,但他们并未在PD患者中对USP24基因进行突变筛查,本研究首次在PD患者中对USP24基因的部分外显子,外显子39-68进行突变筛查,以探讨该基因是否参与PD的发病。方法：对USP24基因的外显子39-68设计引物进行PCR扩增,采用PCR产物直接测序法在92例中国汉族PD患者中对该基因的外显子39-68及外显子-内含子交界区进行突变筛查。结果：在USP24基因的exon39-68中未发现任何碱基变异,但在外显子-内含子交界区检测出11种变异,其中3种为已知多态(rs6588545,rs12031876和rs10493176),位于exon 59的c.7078+22 a>g变异仅在1例以强直为主要临床症状的男性早发性PD患者中检测到,在95例正常人中不存在此变异。结论：在中国汉族PD患者中,未发现USP24基因编码区及剪切位点存在致病突变,位于USP24基因exon 39-exon 68的基因突变可能不是中国PD患者的主要致病原因。