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研究背景:目前,伴随着各种恶性肿瘤的高发,肿瘤治疗相关的继发性淋巴水肿仍是临床治疗难点。导致继发性淋巴水肿的根本原因是手术或放疗造成局部淋巴引流区域结构破坏,而其治疗则缺乏共识,多根据医师经验给予保守治疗、减容手术、淋巴通道旁路手术或淋巴通道重建手术。诸多治疗方案中,通过淋巴结移植进行淋巴通道重建的手术方式因其技术可行性,符合生理结构的再通机制成为研究热点。以乳腺癌为例,整形外科医生利用改良的DIEP或msTRAM皮瓣,在重建乳房的同时,将旋髂浅血管周围淋巴结移植至腋窝腋静脉区域,改善患肢淋巴水肿效果明显,并尝试将此术式用于淋巴水肿预防。另外,既往在羊、狗、大鼠的动物实验中已经证实联合应用血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)的非血管化的淋巴结移植(avascularized lymph nodes transfer,AVLNT),可产生同样的甚至更好的改善淋巴水肿的效果。但对于肿瘤患者而言,恶性肿瘤在疾病初期,肿瘤细胞即可侵袭入血循环,存活下来的肿瘤细胞可处于休眠状态,在复杂机制作用下,肿瘤细胞会复苏并攻克机体免疫防御功能,造成复发、转移病灶的出现。而且,恶性肿瘤细胞表达并分泌促淋巴管生成因子VEGF-C,可增加肿瘤淋巴结、远处脏器转移的机会。故本研究从临床出发,基于肿瘤复发的角度,探索用于治疗继发性淋巴水肿的联合应用VEGF-C的淋巴结移植的安全性问题。目的:1.建立能兼顾肿瘤治疗、肿瘤复发和淋巴结移植两方面要求的动物模型。2.从淋巴结内微环境包括脉管系统、浸润细胞分类、趋化因子及免疫检查点的表达等方面评估再生淋巴结的免疫反应,从而研究其对肿瘤细胞的影响。研究方法:1.实验分组:于实验组A(n=5)、实验组B(n=5)裸鼠进行双侧“类乳腺癌改良根治术”,右腋下非血管化淋巴结移植术,实验组B裸鼠右腋下进行VEGF-C质粒局部注射的操作。对照组(n=5)裸鼠双侧乳腺脂肪垫、双腋下淋巴结未予处理。2.通过小动物活体吲哚菁绿(Indocyanine Green,ICG)荧光成像、淋巴结HE染色、双侧上肢皮肤淋巴管内皮透明质酸受体-1(Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronan Receptor-1,LYVE-1)免疫荧光染色等检查方法评估淋巴结再生、淋巴通道重建的情况。3.培养并接种MDA-MB-231-Luc-GFP肿瘤细胞。实验组A(n=5)、实验组B(n=5)裸鼠于相当于双侧第2对乳腺脂肪垫水平皮下接种含细胞数5×106个细胞的100μL细胞悬液,对照组(n=5)于双侧胸壁第2对乳腺脂肪垫接种包含同等数量肿瘤细胞的细胞悬液。4.利用荧光素酶小动物生物发光活体成像监测肿瘤生长特点。5.收集肿瘤引流区域淋巴结,通过LYVE-1、趋化因子CCL21、高内皮微瓣膜(high endothelialvenule,HEV)、程序性死亡配体-1(programmed death ligand-l,PD-Ll)、F4/80免疫荧光染色定性、定量分析淋巴结微环境。研究结果:1.于5周龄裸小鼠胸壁进行“类乳腺癌改良根治术”、腋窝进行淋巴结清扫、淋巴结移植手术,术中、术后并发症少,术后恢复快,裸鼠能够耐受此类手术操作。2.经ICG小动物活体成像检查,术后1月实验组B(n=5)裸鼠右腋下即可见淋巴结影像。病理HE染色证实,再生的淋巴结组织近似正常淋巴结形态,皮髓质结构清晰、被膜下淋巴窦、髓质淋巴窦可见淋巴管生成,淋巴结内细胞增生。实验组A(n=5)淋巴结呈无功能的纤维化改变,淋巴细胞明显减少。3.外源性VEGF-C的腋下局部注射对胸壁肿瘤局部生长无影响(P<0.05)。4.无转移的实验组B(n=5)肿瘤引流区域再生淋巴结与对照组(n=5)比较,LYVE-1(P<0.001)、F4/80(P<0.01)表达增高,有统计学意义,CCL21、PD-L1、HEV表达两组之间无统计学差异(P>0.05)。实验组B再生淋巴结LYVE-1/CCL21及LYVE-1/F4/80双阳性表达明显增高,较对照组有显著统计学差异(P<0.001)。结论:1.裸鼠能够同时耐受胸壁、腋下的手术操作,联合VEGF-C的非血管化淋巴结移植可在裸小鼠腋窝进行,手术简单易行,术后1月即可实现淋巴结再生,为接种肿瘤提供时间上的可行性。2.VEGF-C基因辅助下再生的淋巴结表现淋巴管内皮细胞增生、髓系衍生的抑制细胞浸润、趋化因子CCL21及免疫检查点PD-L1表达增加的趋势,故推测再生的淋巴结在肿瘤细胞作用下同样呈现出一种外周免疫抑制状态、利于肿瘤细胞迁移、定植、免疫逃逸等反应。