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苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)是一类以MIO(4-亚甲基-咪唑-5-酮)为辅因子的酶,MIO是一种新型的内源性辅因子,是酶蛋白质在翻译后折叠过程中经两次脱水环化而成的具有强亲电性的基团。MIO介导底物α-苯丙氨酸的Cα位的氨基变位至Cβ位,生成β-苯丙氨酸,完成其异构化反应即区域选择性催化反应,同时也能催化中间产物反式肉桂酸的不饱和双键的Cβ位加氨合成β-苯丙氨酸。不同来源的苯丙氨酸变位酶的立体选择性差异较大,如来源于紫杉(Taxus chinensis)的TcPAM催化的产物是R-β-苯丙氨酸,而来源于成团范菌(Pantoeaagglomeran)的PaPAM催化的产物是S-β-苯丙氨酸,由此可以看出区域选择性和立体选择性是苯丙氨酸氨基变位酶两个重要的酶学特性。课题组前期完成了PaPAM的克隆表达以及酶学性质表征,继续对TcPAM进行克隆表达及性质表征。首先化学合成来源于紫杉的氨基变位酶(Tcpam)基因,构建重组质粒pET-sumo-Tcpam,转入大肠杆菌中进行异源诱导表达制备重组酶及酶学性质进行初步研究。在此基础上,对TcPAM以及PaPAM进行突变,研究其对PAM的立体选择性和区域选择性的影响,主要研究结果如下:(1)重组质粒pET-sumo-Tcpam成功在大肠杆菌中实现高效表达,获得可溶性的重组TcPAM,经过亲和层析制备出电泳纯的重组TcPAM。HPLC和MS的结果证明了 TcPAM能够催化α-苯丙氨酸异构化为β-苯丙氨酸。TcPAM在最适温度30℃、pH9的条件下,酶活达到4.11 U/mg,而PaPAM在最适条件下,酶活仅有2.5 U/mg;金属离子Na+、K+、Fe2+和Ca2+对TcPAM和PaPAM的活性影响较小,而Cu2+和Zn2+导致TcPAM和PaPAM的活性具有明显抑制作用;表面活性剂 CTAB、SDS、Triton X-100 和 Tween 80 对重组酶 TcPAM 的活性影响较小,相对酶活保持在90%以上,却对重组酶PaPAM催化反应活性影响较大。比较重组酶TcPAM与PaPAM的酶活表征,发现两种酶具有较好pH稳定性,重组酶PaPAM具有较好的热稳定性,金属离子对重组酶TcPAM的影响较大,表面活性剂对重组 TcPAM 的较小。(2)通过对TcPAM和PaPAM的序列和结果进行比对,发现PaPAM的84位(TcPAM在相对应的位置是86位苯丙氨酸)的甲硫氨酸(M)和91位(TcPAM在相对应的位置是93位精氨酸)异亮氨酸(Ⅰ)对苯丙氨酸氨基变位的区域选择性和立体选择性有重要的影响。因而将TcPAM和PaPAM的这两个位点进行突变,获得PaPAM-M84F、PaPAM-191R、TcPAM-F86M 和 TcPAM-R93I 4 个突变体,研究其对酶催化活性的影响。PaPAM催化α-苯丙氨酸的转化率为25%,而PaPAM-M84F与PaPAM-191R能提高对α-苯丙氨酸催化效率,转化率分别为72.1%和27.9%。TcPAM催化α-苯丙氨酸的转化率为29.7%,TcPAM-F86M和TcPAM-R93I催化α-苯丙氨酸时,检测不到产物。则说明TcPAM和PaPAM的这两个位点的氨基酸对PAM的区域选择性具有影响。用TcPAM、PaPAM、PaPAM-M84F、PaPAM-I91R、TcPAM-F86M和TcPAM-R93I催化不同取代基的芳香丙氨酸,通过HPLC来检测产物的生成,来考察携带有不同取代基团对重组酶的区域选择性分析,得出底物上不同取代基的带电性质以及位置会影响PAM的区域选择性。(3)首先探究TcPAM与PaPAM催化α-苯丙氨酸产物的立体构型,通过HPLC和MS检测催化产物,并且利用圆二色性鉴定了催化产物的立体构型,得出PaPAM催化产物的立体构型为S-β-苯丙氨酸,TcPAM催化产物的立体构型为R-β-苯丙氨酸。利用HPLC手性分析柱检测 PaPAM-M84F、PaPAM-191 R、TcPAM-F86M 和 TcPAM-R93I的催化产物,研究其对立体选择性的影响。PaPAM的催化产物为95%ees的β-苯丙氨酸,而PaPAM-M84F与PaPAM-I91R的催化产物分别为1 8.8%ees和39.4%ees的β-苯丙氨酸。TcPAM的催化产物为95%eeR的β-苯丙氨酸,但是TcPAM-F86M和TcPAM-R93I检测不到产物。TcPAM、PaPAM、PaPAM-M84F、PaPAM-I91R、TcPAM-F86M和TcPAM-R931催化携带不同取代基的底物时,发现底物苯环上携带基团的种类以及位置不同也会影响PAM催化底物的立体选择性。