论文部分内容阅读
研究背景:地方性砷中毒是一种严重危害人类健康的疾病,该病不仅引起皮肤、肝脏等多系统、多脏器损害,危害更大的是可导致皮肤癌、肝癌、肺癌和膀胱癌等发生。地方性砷中毒包括饮水型和燃煤污染型,其中燃煤污染型地方性砷中毒(以下简称燃煤型砷中毒)是我国特有病型,仅发现于我国贵州、陕西两省。砷对机体作用复杂,其致病或致癌机制不清是砷中毒预防和控制的主要难题。 已证实砷暴露可导致DNA、染色体损伤,同时有研究发现砷可抑制一些DNA修复酶表达,且砷暴露者存在DNA修复缺陷,提示DNA损伤及DNA损伤修复受抑均可能在砷毒作用机制中起重要作用。核苷酸切除修复(NER)系统是修复环境中理化因素所致DNA损伤的一个重要修复系统,受损DNA的“识别”、“解旋”和“切除”是NER修复过程中的三个限速步骤,控制核苷酸切除修复进程,XPC、XPD和ERCC1蛋白分别参与此三个关键环节,发挥识别受损DNA、使受损DNA双链发生解旋以及切除受损 DNA的作用。有研究表明,核苷酸切除修复基因变异或表达异常与多种肿瘤发生、发展有关,但其机制并不清楚。 目前研究认为,除遗传学外,尚存在表观遗传学这一重要的基因表达调控机制。DNA甲基化是最重要的表观遗传模式之一,特定基因高甲基化与基因表达沉默密切相关。无机砷在生物体内的甲基化代谢与DNA甲基化过程极为相似,可能存在对甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的竞争,并因此干扰机体DNA甲基化模式。 本研究以该省燃煤型砷中毒人群及体外培养 HaCaT细胞为研究对象,采用重亚硫酸盐测序-定量甲基化特异性 PCR法检测砷中毒患者外周血淋巴细胞、皮肤组织中XPC、XPD基因启动子区CpG岛甲基化状态及ERCC1基因第2外显子区、转录起始点-4901~-4671区CpG岛甲基化状态;实时荧光定量PCR法检测砷中毒患者外周血淋巴细胞中XPC、XPD和ERCC1基因 mRNA表达;免疫组织化学法检测砷中毒患者皮肤组织中XPC、XPD和ERCC1蛋白表达。采用四噻唑蓝法测定亚砷酸钠处理HaCaT细胞中细胞代谢活力,单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤效应;重亚硫酸盐测序法和重亚硫酸盐测序-定量甲基化特异性PCR法检测XPC、XPD基因启动子区CpG岛甲基化状态及ERCC1基因第2外显子区、转录起始点-4901~-4671区CpG岛甲基化状态;实时荧光定量PCR法检测XPC、XPD和ERCC1基因mRNA表达;免疫印迹法检测XPC、XPD和ERCC1蛋白表达。同时用甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(5-AZA-dC)对亚砷酸钠处理HaCaT细胞进行干预,用上述方法分别检测XPD基因启动子区CpG岛甲基化状态、XPD基因mRNA及蛋白表达水平。 人群研究发现:砷中毒患者外周血淋巴细胞和皮肤组织中XPD基因启动子区、ERCC1基因第2外显子区存在高甲基化,且在外周血淋巴细胞和皮肤组织中两者高甲基化存在一致性;XPD、ERCC1基因mRNA及蛋白表达下降,且蛋白表达下降与其高甲基化有关。体外细胞培养实验发现:NaAsO2处理细胞XPD基因启动子区存在高甲基化,呈剂量-效应关系;XPC和XPD基因mRNA及蛋白表达下降,且XPD基因mRNA及蛋白表达下降与其启动子区高甲基化有关。体外干预实验研究观察到5-AZA-dC可逆转NaAsO2所致的XPD基因启动子区高甲基化,且上调XPD mRNA和蛋白表达受抑水平。 全文结论: 1、人群和体外细胞实验研究发现,砷通过导致XPD基因高甲基化改变,继而引起XPD基因mRNA及蛋白表达受抑,其可能通过影响XPD蛋白对受损DNA的解旋,继发性抑制DNA修复,促进砷中毒乃至皮肤癌的发生发展。 2、人群研究发现:①燃煤砷污染致人体ERCC1基因高甲基化,是引起其mRNA及蛋白表达降低的原因之一,ERCC1蛋白参与受损DNA的“切除”步骤可能是砷毒作用主要环节;②砷中毒患者外周血淋巴细胞和皮肤组织中XPD基因启动子区、ERCC1基因第2外显子区高甲基化存在一致性,为两者成为监测砷中毒发生发展的早期生物学标志提供了重要线索。 3、体外干预实验研究发现,DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷可逆转砷所致的XPD基因高甲基化,上调其mRNA及蛋白表达受抑水平,该结果进一步表明了砷致XPD基因启动子区高甲基化是导致其mRNA及蛋白表达受抑的主要原因,提示深入研究砷的表观遗传模式不仅有助于阐明砷的致病或致癌机制,而且为砷中毒的治疗提供了新的思路和方向。