【摘 要】
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目的构建T细胞活化连接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表达载体,以及利用基因点突变技术使LAT-EGFP的棕榈酰化位点突变构建LAT-EGFP-M真核表达载体,并将两种真核表达载体转染入J
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目的构建T细胞活化连接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表达载体,以及利用基因点突变技术使LAT-EGFP的棕榈酰化位点突变构建LAT-EGFP-M真核表达载体,并将两种真核表达载体转染入Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59在T细胞信号转导过程中与LAT的相互作用,探讨CD59向胞内传递信号的机制。方法从人T细胞白血病细胞Jurkat细胞中提取总RNA,利用RT-PCR的方法扩增LAT基因,构建LAT-EGFP真核表达载体,并利用点突变技术使LAT-EGFP近膜处的棕榈酰化位点的络氨酸替换为甘氨酸,构建棕榈酰化位点突变的LAT-EGFP-M真核表达载体：采用电转染的方法转染Jurkat细胞,双抗交联CD59后,荧光共聚焦显微镜下观察LAT分布情况的变化：用噻唑蓝(MTT)比色法检测抗体交联前各组后Jurkat细胞增殖情况差别；应用ELISA检测各组细胞上清中IL-2的变化水平；用Western blot技术检测抗体交联后LAT-EGFP和LAT-EGFP-M的磷酸化程度。结果经限制性内切酶酶切、western blot技术及测序鉴定LAT-EGFP真核表达载体和LAT-EGFP-M构建成功；抗体交联CD59之后,LAT-EGFP-M较LAT-EGFP相比不能定位聚集于CD59所在的脂筏区域,并且转染了突变LAT-EGFP-M质粒的Jurkat细胞增增速度和IL-2分泌能力低于转染LAT-EGFP质粒的对照组。转染空载体EGFP-N3及未转染的细胞,LAT-EGFP-M的磷酸化程度远低]LAT-EGFP。结论LAT参与CD59信号转导过程,并且二者作用位点与棕榈酰化基团有关。这为研究CD59类GPI锚固蛋白的信号转导方式奠定了基础。
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