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用PCR-RFLP技术筛选ERα不同基因型(AA、AB、BB)小梅山性成熟青年母猪,屠宰测定其卵巢、子宫组织学特性。结果ERα三种基因型个体间卵巢重、子宫重、卵巢长、卵巢宽、子宫角长之间差异不显著(P>0.05),发情周期长短无明显差异(P>0.05),乳头数无明显差异(P>0.05)。 用地高辛标记探针的非同位素原位杂交法(ISH)测定小梅山猪发情周期第2天、7天、12天、17天卵巢、子宫内ERαmRNA的细胞定位与相对丰度变化。卵巢中ERαmRNA杂交信号出现在各级卵泡的颗粒细胞中,早期黄体中一些细胞ERα基因表达微弱,卵母细胞未有阳性染色存在。在整个发情周期中卵巢ERαmRNA低水平表达,但在发情周期第17天有上升的趋势。子宫中阳性颗粒主要出现在子宫内膜上皮腺体细胞中,基质部分少量分布,也见于子宫平滑肌细胞。子宫内膜ERαmRNA呈现发情周期依赖性变化,在发情周期第17天显著高于发情周期第12天(P<0.01)。放射免疫测定(RIA)发情周期第2天、7天、12天、17天血浆E2水平,与ERαmRNA表达呈现出同步性变化,两者显著相关(P=0.042)。 用RT-PCR技术从小梅山猪子宫中成功扩增出ERα基因E区部分序列cDNA,546bp,其含有182个氨基酸,预测分子量21.1Kda,具有潜在的E2结合功能结构域。ERαE区序列与已发表的人、牛、羊、鸡的氨基酸序列同源性分别为97.3%,97.8%,96.7%,和95.1%。将克隆到pGEM-T easy质粒中的ERαE片段通过PCR扩增并插入到原核表达载体pGEX-6P-1的谷胱甘肽酶基因的下游,获得重组表达质粒pGEX-6p-1-ERαE。将重组质粒导入大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达,通过大肠杆菌菌体的裂解物SDS-PAGE电泳分析结果表明重组菌满意表达GST-ERαE融合蛋白,分子量约为49Kda,与预期大小一致,电泳扫描净灰度达32%。 本研究结果探讨了ERα基因型与猪繁殖器官解剖学的关系,测定了ERαmRNA在猪发情周期不同组织的表达规律,揭示ERα基因E区分子结构,为开展标记辅助选择(MAS),阐明梅山猪高繁殖力的分子生物学机制,以及进行ERα蛋白免疫与应用研究奠定了基础。