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研究背景:肺癌是我国发病率及死亡率最高的恶性疾病,严重危害人类健康。糖基化作为重要的蛋白质翻译后修饰之一,其改变与癌症的发生发展密切相关。研究表明,肺癌患者组织、血清及胸腔积液中均伴有糖蛋白糖链结构的改变,但目前对不同类型肺癌组织中的糖蛋白糖链的变化和肺癌患者唾液中是否存在类似的糖链变化尚不清楚,是亟待研究的问题。因此,本研究拟以肺鳞状细胞癌（Squamous cell carcinomas,SCC）,肺腺癌（Adenocarcinomas,ADC）,小细胞肺癌（Small-cell lung cancer,SCLC）患者肿瘤组织及唾液为研究对象,利用凝集素芯片技术研究与肺癌相关的特异性糖链结构,并结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/TOF-MS）解析相关糖链的结构信息,以期为肺癌相关的糖蛋白异常糖基化发生的分子机制及发现肺癌诊断的糖链生物标志物提供理论依据。研究方法:1.利用凝集素芯片技术分析SCC患者肿瘤组织及其癌旁组织的糖蛋白糖链谱,筛选与SCC相关的异常糖蛋白糖链,并通过凝集素印迹,q RT-PCR及凝集素组织化学验证筛选的异常糖蛋白糖链的表达和分布;采用MALDI-TOF/TOF-MS技术进一步解析SCC肿瘤组织及癌旁组织的N-聚糖结构;2.利用凝集素芯片技术检测ADC患者肿瘤组织及其癌旁组织的糖蛋白糖链谱,筛选与ADC相关的异常糖蛋白糖链,并通过凝集素印迹及凝集素组织化学验证筛选的异常糖蛋白糖链的表达和分布;采用MALDI-TOF/TOF-MS技术进一步解析ADC肿瘤组织及其癌旁组织的N-/O-聚糖结构;3.利用凝集素芯片技术检测健康志愿者（HV）、SCC、ADC及SCLC患者唾液糖蛋白糖链谱,筛选与肺癌相关的唾液异常糖蛋白糖链,并结合二元Logistic逐步回归分析构建SCC、ADC及SCLC诊断模型及用ROC曲线评估构建模型的诊断准确性;4.利用PNGase F酶切法及NaClO氧化法,分别从HV、SCC、ADC和SCLC患者唾液糖蛋白中分离N-/O-聚糖,然后通过MALDI-TOF/TOF-MS技术解析糖链结构,比较分析肺癌患者唾液中的特异性N-/O-聚糖结构;5.系统性的比较分析SCC、ADC及SCLC患者肿瘤组织、血清和唾液之间糖蛋白糖链谱差异。研究结果:1.通过7对SCC肿瘤组织及其癌旁组织的糖蛋白糖链谱分析,结果显示:Fucα-1,6Glc NAc（核心岩藻糖）糖链结构在SCC肿瘤组织中的相对丰度显著高于癌旁组织;凝集素印迹及q RT-PCR结果显示,SCC肿瘤组织中Fucα1-6Glc NAc糖链结构的相对丰度及调控其合成的糖基转移酶FUT8基因的表达水平显著高于癌旁组织;凝集素组织化学结果显示,Fucα1-6Glc NAc糖链结构在SCC肿瘤组织细胞表面和细胞质区域出现异常积累;SCC组织N-聚糖结构的鉴定结果显示,SCC肿瘤组织中的岩藻糖基化N-聚糖种类多于癌旁组织,且有5种岩藻糖基化N-聚糖（m/z 2564.911、2816.025、3175.17、3273.218和3433.255）仅存在于SCC肿瘤组织中。2.通过7对ADC肿瘤组织及其癌旁组织的糖蛋白糖链谱分析,结果显示:凝集素AAL识别的Fucα1-6 Glc NAc和Fucα1-3（Galβ1-4）Glc NAc糖链结构,凝集素PHA-E+L识别的Bisecting Glc NAc,bi-antennary N-glycans,tri-and tetra-antennary complex-type糖链结构在ADC肿瘤组织中的相对丰度显著高于癌旁组织,凝集素印迹结果与糖蛋白糖链谱分析结果一致;凝集素组织化学结果表明,ADC肿瘤组织细胞表面和细胞质中Complex-Type N-聚糖的表达增多;ADC组织N/O-聚糖结构的鉴定结果显示,有12种N-聚糖（例如,m/z1479.547,1647.587及1869.711等）及8种O-聚糖（例如,m/z 604.203,973.237及1005.320等）仅存在于ADC肿瘤组织中。3.凝集素芯片结果显示:唾液糖蛋白糖型的改变可区分SCC,ADC和SCLC患者,用于判定是否患有肺癌的模型（Model LC）在训练集中达到较好诊断效果（AUC:0.971,敏感度:0.953,特异性:0.810）,用于判定是否患有SCC的模型（Model SCC:AUC:0.930,敏感度:0.913,特异性:0.842）,用于判定是否患有ADC的模型（Model ADC:AUC:0.892,敏感度:0.877,特异性:0.735）及用于判定是否患有SCLC的模型（Model SCLC:AUC:0.826,敏感度:0.882,特异性:0.714）在训练集中均达到较好诊断效果;此外,Model LC、Model SCC、Model ADC和Model SCLC在验证集中的AUC值均大于0.700。4.HV、SCC、ADC和SCLC患者唾液糖蛋白中分别鉴定到23/38、27/35、37/20及35/27种N/O-聚糖,其中,有6种N-聚糖（例如,m/z 1876.649,2012.719及2094.748等）及3种O-聚糖（m/z 604.203,774.272及958.307）仅存在于SCC组,有5种N-聚糖（例如,m/z 2061.7385,2303.814及2361.856等）及4种O-聚糖（例如,m/z 1156.420,1213.440及1390.490）仅存在于ADC组,有4种N-聚糖（例如,m/z 1768.570,2319.809及2687.990）及4种O-聚糖（例如,m/z 1077.340,1208.396及1223.400等）仅存在于SCLC组。5.SCC、ADC及SCLC患者肿瘤组织、血清和唾液糖蛋白糖链谱的比较分析结果显示,有34种凝集素识别的糖蛋白糖链结构在肺癌患者肿瘤组织、血清、唾液中具有显著差异,其中,有24种凝集素（例如STL,PNA和Con A等）识别的糖链结构在SCC患者肿瘤组织/血清/唾液中具有显著差异,27种凝集素（例如Jacalin,HHL和DBA等）识别的糖链结构在ADC患者肿瘤组织/血清/唾液中具有显著差异,21种凝集素（例如PHA-E,LCA和NPA等）识别的糖链结构在SCLC患者肿瘤组织/血清/唾液中具有显著差异。研究结论:肺癌组织与其癌旁组织,以及肺癌患者唾液与健康志愿者唾液糖蛋白糖链谱均具有显著差异,从癌组织及肺癌患者唾液中分离的糖蛋白存在特异表达的N-/O-聚糖结构。基于唾液糖蛋白糖型建立的肺癌诊断模型具有较好的患病样本鉴别能力。此外,肺癌患者组织、血清和唾液间糖蛋白糖链谱也具有显著差异。本研究系统性的分析了肺癌组织及唾液糖蛋白糖链谱,为阐明肺癌相关的糖蛋白异常糖基化发生的分子机制及发现肺癌诊断的糖链生物标志物提供了理论依据。