【摘 要】
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该课题用巴斯德华赤酵母(pichia pastoris)表达系统对AT-Ⅲ基因进行表达.具体内容包括下面几部分:(1)载体的构建.利用计算机程序进行引物设计,由真核细胞载体pcDNA3.1-ATⅢ中
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院
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该课题用巴斯德华赤酵母(pichia pastoris)表达系统对AT-Ⅲ基因进行表达.具体内容包括下面几部分:(1)载体的构建.利用计算机程序进行引物设计,由真核细胞载体pcDNA3.1-ATⅢ中扩增AT-Ⅲ基因,两种引物设计使重组AT-Ⅲ信号肽分别采用两种形式:宿主的信号肽和AT-Ⅲ天然信号肽.扩增的AT-ⅢcDNA测序正确后,装入pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-AT.(2)转化和表达.将构建好的载体利用电穿孔仪转入巴斯德华赤酵母中表达,测活.利用SDS-PAGE及Westernblot鉴定.结果表明,表达活性良好.并对表达培养基的条件进行了优化.(3)纯化.将发酵液离心,上清经0.22μm膜过滤,采用亲和层析法(肝素亲和层析柱),将产物初步纯化,产物纯度可达95﹪以上.(4)AT-Ⅲ的DNA改组研究.将AT-Ⅲ基因以DNAaseI部分酶解,经无引物和有引物两步PCR扩增,形成与原基因大小相似的改组基因库,再转入毕赤酵母中表达,筛选高表达株,已筛选到15株.所以,我们成功地在巴斯德华赤酵母中表达了AT-Ⅲ,并对其进行了DNA改组的初步研究.
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