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目前,转座子法筛选变异材料和克隆功能基因是主流方法之一。转座子法中,Ac/Ds(Activator/Dissociation)标签系统是构建插入突变体库较为理想的方法。Ac-Ds系统是玉米hAT家族中的成员,包括自主转座元件Ac和非自主转座元件Ds。AcTPase基因能在自身转座酶的作用下进行转座,但是Ac不断自主转座,使转座植株难以稳定,不利于研究。因此,本研究将具有自主转座能力的AcTPase加以改造使其能够合成转座酶,但是缺失转座序列,丧失了转座能力。Ds元件不具有编码转座酶的功能,只有在Ac转座酶存在的情况下才能转座。诱导型表达转座酶基因,可以使转座过程变得可控,既能显著提高转座频率,又能快速稳定插入事件。本实验中,主要研究结果如下:1)分别构建了乙醇诱导型Ac/Ds转座系统pHL1和地塞米松诱导型Ac/Ds转座系统pHL2,使用化学诱导剂乙醇和地塞米松诱导Ac转座酶的表达,可以有效的实现在转基因植物中特定发育阶段的高频率Ds转座。在乙醇诱导系统中,包括编码转录因子ALCR的alcR基因以及乙醇诱导型启动子palcA两部分,在没有乙醇的情况下,alcA启动子不能起始AcTPase基因的表达;当添加乙醇后,乙醇结合到ALCR蛋白上,改变其构象,使其结合到alcA启动子上,从而起始AcTPase基因的表达。在地塞米松诱导系统中,将编码转座酶的基因AcTPase与糖皮质激素受体GR基因融合,形成融合基因,表达出含有GR受体的融合蛋白,Ac转座酶的C末端与GR融合,融合蛋白位于细胞核的外面,与热激蛋白结合,形成的复合物处于无活性的状态,当添加类固醇配体后,融合蛋白从复合物中释放出来,进入细胞核,作用于其识别位点,引起Ds元件从靶位点切离,本实验中所使用的类固醇配体是地塞米松。在pHL1,pHL2载体中,都含有GFP,GUS报告基因。GFP基因在Ds元件的内部,随着Ds的转座而转座,所以GFP荧光的存在可以揭示Ds-GFP的存在,从而可以方便的检测到Ds-GFP自T-DNA上的切离和旁邻区域再插入事件的发生。pCaMV35S启动子和GUS报告基因位于Ds-GFP的两端,Ds-GFP的切离将导致GUS基因的表达,因此通过对植株进行GUS染色,可以检测Ds-GFP元件的转座。2)将pHL1转化拟南芥,得到单拷贝纯合体株系后,通过半定量PCR方法分析其诱导情况,结果显示,诱导后,AcTPase表达量有十几倍的增加。通过GUS染色,巢式PCR分析Ds空供体位点等方法分析Ds-GFP元件转座情况,结果显示,有Ds-GFP转座事件的发生。并在乙醇处理后的植株后代中,筛选到GUS染色全蓝的株系,即Ds稳定转座的株系。3)将pHL2载体转化拟南芥,得到单拷贝纯合体株系后,通过GUS染色,结果显示有Ds-GFP转座事件的发生,并在地塞米松处理后的植株后代中,筛选到GUS染色全蓝的株系,即Ds稳定转座的株系。