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目的:疟疾是经媒介按蚊传播引起的严重威胁人类健康的寄生原虫感染性疾病。全球每年约有2亿700万疟疾病例,60万人死于疟疾感染。疟原虫在人体内可以分为肝期无性增殖和红内期裂体增殖,其中红内期是疟原虫致病并引起感染宿主产生严重临床症状的主要阶段。疟原虫感染红细胞的结构和功能改变可帮助疟原虫逃避宿主免疫系统的清除,并对宿主产生严重致病性和致死性。红细胞结构和功能等一系列变化的产生,源于红内期原虫向宿主红细胞胞浆和感染红细胞膜表面分泌大量原虫蛋白,而原虫蛋白的分泌又有赖于红内期原虫自身建立的独特网状蛋白转运系统。SURFIN是近年研究发现的疟原虫蛋白家族,属于目前尚未阐明转运机制的PNEPs(PEXEL negative exported proteins,PNEPs)蛋白家族。SURFIN蛋白在恶性疟原虫感染红细胞黏附宿主内皮细胞和裂殖子侵袭过程中发挥重要作用。因此,本研究拟选取恶性疟原虫SURFIN1.1蛋白,通过分子生物学和免疫学相关技术,阐明介导SURFIN1.1蛋白转运的相关序列,从而为抗疟新药靶位的研发提供理论依据。研究方法:通过生物信息学分析恶性疟原虫SURFIN1.1蛋白结构域,跨膜区等基本信息。运用单同源臂重组技术构建SURFIN1.1蛋白全长的C端融合GFP标签虫株(SURFIN1.1full-GFP)。同时,采用多位点重组技术(MultiSite Gateway Technology)构建含有SURFIN1.1不同结构域的表达载体,并转染入恶性疟原虫3D7虫株,药物筛选获得各转染株。采用免疫印迹(WB)和间接免疫荧光(IFA)检测各SURFIN1.1转染株的表达和定位情况。结果:1、采用生物信息学软件预测了SURFIN1.1的结构域,SURFIN1.1包含N端、半胱氨酸富含区(Cysteine-rich domain,CRD)、可变区(Variable domain,Var)、跨膜区(Transmembrane domain,TM)以及胞内三个色氨酸富含区(Tryptophan-rich domains,WRDs)。2、成功构建pSLI-2×FKBP-SURFIN1.1-GFP载体,转染并筛选出SURFIN1.1full-GFP转染株。IFA检测显示SURFIN1.1full-GFP的绿色荧光在感染红细胞(infected red blood cell,iRBC)胞浆呈点状分布,与茂氏点定位蛋白SBP1共定位。3、疟原虫体内成功表达SURFIN1.1NCVT-Cyt(N:N-terminal;C:cysteine rich domain,CRD;V:variable domain,Var;T:transmembrane domain,TM;Cyt:cytosolic region,Cyt)和SURFIN1.1N-T-Cyt重组蛋白。IFA检测显示SURFIN1.1NCVT-Cyt和SURFIN1.1N-T-Cyt重组蛋白呈点状分布于iRBC胞浆,与茂氏点定位蛋白SBP1共定位。4、疟原虫体内成功表达SURFIN1.1N-T,SURFIN1.1N-Cyt,SURFIN1.1T-Cyt重组蛋白。IFA检测显示,SURFIN1.1N-T重组蛋白呈点状分布于iRBC胞浆,与茂氏点定位蛋白SBP1共定位。而SURFIN1.1N-Cyt,SURFIN1.1T-Cyt重组蛋白定位于疟原虫虫体胞浆。5、疟原虫体内成功表达SURFIN重组蛋白N端截短系列载体:SURFIN1.1N1-T-cyt(N1:1-20 aa),SURFIN1.1N2-T-cyt(N2:1-40 aa),SURFIN1.1N3-T-cyt(N3:40-50 aa),SURFIN1.1N4-T-cyt(N4:20-40aa),SURFIN1.1N5-T-cyt(N5:10-30 aa)重组蛋白。IFA检测SURFIN1.1N1-T-cyt和SURFIN1.1N3-T-cyt重组蛋白定位于疟原虫虫体胞浆。SURFIN1.1N2-T-cyt,SURFIN1.1N4-T-cyt,SURFIN1.1N5-T-cyt重组蛋白呈点状分布于iRBC胞浆,与茂氏点定位蛋白SBP1共定位。结论:1、SURFIN1.1为红内期原虫输出蛋白,定位于iRBC胞浆的茂氏点。2、SURFIN1.1蛋白N端的50个氨基端(1–50 aa)加上跨膜区(TM)以及胞内尾(Cyt)含有介导重组蛋白转运至iRBC胞浆的蛋白基序。3、SURFIN1.1蛋白的TM介导重组蛋白进入内质网-高尔基体经典分泌途径。4、N端序列“RSGPFEIWRK”(21–30 aa)为SURFIN1.1N-T-Cyt重组蛋白N端介导跨纳虫泡膜的转运的重要基序。