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研究目的：
本研究用培养的C2C12为细胞模型,在电刺激模拟神经冲动下引起其收缩,探讨该细胞在电刺激强度相同,时间不同的情况下,补充肌酸对其AMPKα1、HKⅡ及GS—1基因表达等信号转导通路相关指标的影响。
研究方法：
常规培养C2C12细胞,融合达90％左右时加入分化培养基。待分化7天后,一次性电刺激分化7天的C2C12肌管60min、120min,即刻收样,检测细胞内肌糖原含量和LDH活性,作为确定电刺激时间的依据。
以骨骼肌C2C12细胞为研究对象,细胞分化5天后,随机将细胞分为6组:对照组(C)、电刺激组(E)、0.5mM肌酸组(0.5Cr)、0.5mM肌酸+电刺激组(0.5Cr+E)、2mM肌酸组(2Cr)、2mM肌酸+电刺激组(20r+E).分别用0.5mM和2mM肌酸处理48小时。随后一次性电刺激(15v,30ms,3Hz)C2C12肌管60min和120min,即刻收样。严格按照实验步骤及要求,测定C2C12肌管糖原含量以及AMPKα1、HKⅡ及GS-1mRNA的表达。
研究结果：
1、随着时间的延长,电刺激120min与60min相比,肌糖原含量明显下降(P>0.05),但与C组相比有显著性差异(P<0.05)。电刺激60min糖原含量略高于对照组(P>0.05)。对照组、电刺激60min和120min组的LDH活性组间无显著差异(P>0.05)。
2、电刺激60min,E组糖原含量略高于C组(P>0.05)；0.5Cr+E组、2Cr组、2Cr+E组糖原含量高于E组(P>0.05)。
电刺激120min,E组糖原含量显著低于C组(P<0.05)；其余各组与C组相比均无差异。0.5 Cr组、2Cr组糖原含量分别高于0.5Cr+E组和2Cr+E组(P>0.05)；2Cr组与0.5Cr组相比略有上升(P>0.05)。
3、电刺激60min,E组、0.5Cr+E组、2Cr+E组AMPKα1mRNA表达均极显著高于C组(P<0.01)；2Cr组显著高于C组(P<0.05),0.5Cr+E组、2Cr+E组AMPKα1mRNA表达有极显著高于0.5Cr组、2Cr组的趋势(P<0.01)。
电刺激120min,E组、0.5Cr+E组、2Cr组、2Cr+E组AMPKα1mRNA表达极显著高于C组(P<0.01)；0.5Cr组显著高于C组(P<0.05),0.5Cr+E组AMPKα1mRNA表达显著高于E组(P<0.05)。2Cr组AMPKα1mRNA表达有显著高于0.5Cr组的趋势(P<0.05)。
4、电刺激60rain,E组、0.5Cr+E组、2Cr+E组HKⅡmRNA表达均极显著高于C组(P<0.01)；2Cr+E组显著低于E组(P<0.05)。电刺激120min后,各组HKⅡmRNA表达与C组相比均无显著性差异(P>0.05)。
5、电刺激60min,E组、0.5Cr+E组GS-1mRNA表达均极显著性高于C组(P<0.01):2Cr+E组GS-1mRNA表达显著高于C组(P<0.05),但与E组相比,其GS—1mRNA表达极显著的下降(P<0.01)。
电刺激120min,E组GS—1mRNA表达极显著的高于C组(P<0.01)。2Cr组、2Cr+E组与E组相比有显著的下降(P<0.05)。
结论：
1、以电刺激方式来模拟神经冲动,随着刺激时间的延长,C2C12肌管糖原消耗增大。电刺激前肌酸孵育48小时,能够有效促进C2C12肌管糖原的合成,并保持电刺激期间糖原维持在较高水平。
2、电刺激60min、120min均能引起C2C12肌管AMPKα1mRNA表达升高(P<0.01)。电刺激60min,2mM Cr能上调AMPKα1mRNA表达(P<0.05)；电刺激120mi n,0.5mMCr(P<0.05)和2mM Cr(P<0.01)均能增加AMPKα1mRNA表达。同样补充肌酸也能增加电刺激后AMPKα1mRNA的表达(P<0.01)。可以认为电刺激和肌酸孵育可能是通过激活AMPKα1从而调节下游分子加速糖代谢过程,进而促进糖原的合成。
3、电刺激60min可以极显著增加C2C12肌管HKⅡmRNA表达(P<0.01),电刺激120min各组HKⅡ mRNA相对表达量高于电刺激60 min,可能原因电刺激致使培养基中的物质影响了调节基因表达的相关因子,造成HKⅡ mRNA表达减少。因此推测AMPK可能通过上调HKⅡ的基因表达,从而加速了HK磷酸化葡萄糖产物G-6-P,与GLUT4协同调节糖原合成。
4、电刺激能够上调C2C12肌管GS-1mPNA表达(P<0.01),AMPK作为GS的上游激酶对GS活性有抑制的作用,但肌糖原浓度和HK磷酸化的G-6-P变构激活GS,增加C2C12肌管GS—1mRNA表达,从而促进糖原的合成。补充肌酸对GS-1mRNA表达没有显著增加的作用,因此推测调节肌细胞内GS可能还受到其他很多因素的影响,如其它下游激酶或酶活性等。