硒作为一种人体必需的微量元素,在多种生理活动中扮演重要角色,临床研究表明硒还可以用来治疗肿瘤。大量的文献证实超营养剂量的硒能诱导细胞周期阻滞及凋亡,对一些恶性肿瘤具有显著的治疗效果,因此硒治疗肿瘤的分子机制也成为研究热点。结直肠癌是一种常见的下消化道恶性肿瘤,治愈率较低,而且发病率在我国呈现逐年增高的趋势,因此研究亚硒酸钠治疗结直肠癌的分子机制具有非常重要的意义。本课题组的前期研究成果表明：超营养剂量的亚硒酸钠能够诱导白血病、结直肠癌等恶性肿瘤细胞的凋亡,但是亚硒酸钠诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制还有待阐明。本研究旨在探索亚硒酸钠处理的结直肠癌细胞中与凋亡相关的信号通路,进一步揭示亚硒酸钠诱导细胞凋亡的分子机制,为其临床应用提供理论依据。通过前期探索,本研究以结直肠癌HCT116和SW480细胞为研究对象,首先发现亚硒酸钠对核转录因子CREB的磷酸化水平具有明显的抑制作用,而CREB被报道在肿瘤的生存、迁移等方面扮演重要作用。我们首先通过免疫荧光,染色质免疫共沉淀等试验探索亚硒酸钠处理的细胞中CREB功能的变化。结果发现亚硒酸钠处理造成的CREB磷酸化水平下调导致了其与靶基因Bcl-2启动子区结合减弱,从而诱导Bcl-2表达水平下调和细胞凋亡的产生。进一步使用CREB-CBP结合抑制剂与亚硒酸钠联合使用,实验结果进一步证实亚硒酸钠是通过降低细胞内CREB的转录活性,造成Bcl-2表达水平的下调和线粒体介导的内源性凋亡的产生。进一步探索发现,蛋白激酶D1 (PKD1)在结直肠癌细胞内与CREB存在直接的相互作用,且二者的相互作用在亚硒酸钠处理后减弱。Western blot等结果则揭示了,PKD1的磷酸化水平直接影响CREB的转录活性及其靶基因Bcl-2的表达。通过使用PKD1激酶抑制剂和激活剂与亚硒酸钠联用,我们发现PKD1对CREB的调控依赖于自身的激酶活性,亚硒酸钠是通过抑制PKD1的激酶活性来降低CREB的转录活性进而造成Bcl-2表达下调。进一步通过免疫共沉淀、免疫荧光等试验发现,在亚硒酸钠处理造成p38 MAPK激活并抑制PKD1/CREB/Bcl-2生存途径,当过表达p38 MAPK激酶缺失型质粒或对其激酶活性进行抑制,亚硒酸钠诱导的PKD1/CREB磷酸化抑制及Bcl-2表达下调过程被逆转。同时,western blot和流式细胞术检测结果也都证实了,亚硒酸钠处理的结直肠细胞中,p38 MAPK被激活并进一步造成了PKD1/CREB/Bcl-2生存途径的抑制和凋亡的产生。本课题在研究Bcl-2介导的线粒体凋亡过程中,还发现Bcl-2家族中的Bad在亚硒酸钠诱导的细胞凋亡过程中也扮演重要作用。线粒体蛋白的western blot检测和免疫荧光检测结果表明,亚硒酸钠处理的结直肠癌细胞中,Bad从胞浆转位至线粒体并激活内源性凋亡。我们发现14-3-3蛋白在Bad的胞浆储存和线粒体转位中扮演重要角色,免疫共沉淀和western blot检测结果也表明了亚硒酸钠处理造成了Bad的去磷酸化和从14-3-3蛋白的释放。进一步免疫荧光及免疫共沉淀结果揭示了,AKT介导了PKD1对Bad磷酸化水平的调控,造成了Bad的线粒体转位。这些结果表明了,亚硒酸钠还通过PKD1/AKT通路促使了Bad的转位和线粒体凋亡的发生。活性氧(ROS)作为上游触发因子,在亚硒酸钠诱导的细胞凋亡过程中扮演非常重的角色。首先,本课题使用DCFH-DA探针检测亚硒酸钠处理的结直肠癌细胞中ROS的变化,结果发现亚硒酸钠处理的HCT116和SW80细胞中ROS水平在一定的时间范围内不断升高。使用ROS的阳性对照试剂过氧化氢和ROS清除剂MnTMPyP与亚硒酸钠联合使用后进行western blot检测,结果表明ROS确实是p38MAPK/PKD1信号通路以及细胞凋亡的重要上游调控因子。为了验证体外细胞学研究的结果,本课题还建立了HCT116, SW480两株细胞系的裸鼠移植瘤模型,并对亚硒酸钠在体内治对肿瘤的疗效进行检测,结果发现亚硒酸钠能够明显抑制小鼠体内肿瘤的生长且无明显毒性。我们又通过免疫组织化学和western blot等方法对肿瘤组织样本中相应细胞学的结果进行了验证,结果表明上述信号通路在肿瘤组织与体外细胞学实验获得相似的变化趋势。研究结果进一步支持了亚硒酸钠在体内、外同时具有诱导结直肠癌细细胞凋亡的作用。我们的发现为亚硒酸钠治疗结直肠癌提供了全新的视角,也为亚硒酸对肿瘤的临床治疗提供了重要的理论和实验依据。